[發明專利]一種土壤中殘留bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法有效

申請號：	201510452807.3	申請日：	2015-07-28
公開（公告）號：	CN105137061A	公開（公告）日：	2015-12-09
發明（設計）人：	方志翔;劉標;沈文靜;李衍亮	申請（專利權）人：	環境保護部南京環境科學研究所
主分類號：	G01N33/535	分類號：	G01N33/535
代理公司：	南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204	代理人：	王艷
地址：	210042 ***	國省代碼：	江蘇;32
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	一種土壤殘留 bt 蛋白原位免疫定量檢測方法
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明涉及蛋白檢測技術領域，具體涉及一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法。

背景技術

近年來，隨著轉Bt作物種植面積的不斷擴大，其對生態環境的潛在風險也日益成為國內外專家和學者研究的熱點。轉Bt作物在種植以后，在其整個生長期內，會通過根系分泌物、花粉、植物殘茬向土壤釋放Bt毒素，這些分泌的Bt毒素會被土壤中的粘土礦物和腐殖質等表面活性顆粒吸附，且該結合態毒素仍具有較強的殺蟲活性，在土壤環境中可長時間存留。土壤是生態系統中物質循環和能量轉化的重要場所，土壤中的動物和微生物種群對于土壤生態系統的物質降解和能量轉換起著非常重要的作用。這些殘留的毒素可能會對土壤中無脊椎動物、微生物種群產生潛在的毒性，影響土壤動物及微生物種群的多樣性結構，從而破壞土壤的物質循環和能量轉換。因此，研究轉Bt基因植物毒蛋白在土壤中的殘留和降解動態對于保護生態環境安全具有十分重要的意義。

目前，對于土壤中殘留Bt蛋白的檢測方法，主要通過提取液從土壤中提取Bt蛋白后進行ELISA法檢測。目前提取土壤中殘留Bt蛋白的方法主要有SDS法,碳酸鹽法、人造蠕蟲腸道蛋白提取液法、PBST試劑盒法等方法。上述這些方法在土壤殘留Bt蛋白檢測中發揮了一定的作用，但是也都存在一定的缺陷。現有的這些檢測土壤bt蛋白的方法，均為先用提取液提取bt蛋白后，再進行檢測，該方法操作簡單，但是用于土壤這種吸附力很強的介質的時候，往往效果不會很理想，一些牢固吸附在土壤顆粒表面的bt蛋白很難被洗脫下來，因此不能反映土壤中Bt蛋白的真實殘留含量。

發明內容

發明目的：本發明針對目前現有土壤Bt蛋白檢測方法的弊端，研發出了一種新的直接在土壤顆粒表面進行原位酶聯免疫定量檢測bt蛋白的方法，該方法可以不經過提取直接精確檢測出吸附于土壤顆粒表面的難提取bt蛋白，真實反映出土壤中Bt蛋白的殘留情況。同時，結合現有的檢測提取液中bt蛋白的方法，兩者的數據相加，可以完整的得到土壤中bt蛋白的真實含量。本發明為監測Bt蛋白在土壤中的殘留及其對土壤生態系統的影響提供了一條新的途徑，而且本方法不僅僅可以用于土壤bt蛋白的檢測，在更換不同的抗體后更可以用于檢測各種土壤中的殘留蛋白含量。

技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，包括以下步驟：

1)去除待測土樣中的動植物殘體，充分研磨，通過50-60目篩子使得土壤粒徑在0.2mm以下；

2)將研磨后的土樣在高壓濕熱條件下滅菌15-20分鐘；

3)稱取滅菌后的土樣1-2g，放入10ml離心管中進行清洗去除土壤雜質；

4)對去除過雜質的土壤土樣表面進行封閉；

5)對封閉后的土壤土樣進行抗體結合檢測：

5.1)向封閉后的土樣中加入3ml反應液Ⅰ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育2h，期間每隔20min顛倒離心管數次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.2)加入洗滌液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min；之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.3)重復步驟5.2)三到五次；

5.4)加入3ml反應液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育1h，期間每隔20min顛倒離心管數次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.5)加入洗滌液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min；之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.6)重復步驟5.5三到五次；