[發(fā)明專利]基于磁珠法提取淤泥微生物基因組DNA的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510449610.4
• 申請(qǐng)日: 2015-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN105018469A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王清水;余彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 福州君誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于磁珠法提取淤泥微生物基因組DNA的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

淤泥中蘊(yùn)含著豐富的微生物，不同的微生物有著不同的價(jià)值，研究表明在淤泥中，微生物群落共同合作將分子量更大、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的有機(jī)化合物分解成醋酸鹽的形式。然后，Geobacters微生物菌種就將電子從醋酸鹽中轉(zhuǎn)移至產(chǎn)生電能的電極。一些Geobacter能夠?qū)⒂卸镜挠袡C(jī)物如甲苯等轉(zhuǎn)化為帶電，然而更深入地了解微生物發(fā)電的原理，以及其他微生物的作用，需要利用基因組學(xué)對(duì)其進(jìn)行研究。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)微生物的方法是淤泥微生物多樣性研究最早運(yùn)用的方法。但是，能夠在培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌僅占不到環(huán)境微生物總量的l％。近10年來日益成熟的分子生物學(xué)技術(shù)突破了傳統(tǒng)技術(shù)手段的局限，給淤泥微生物研究帶來了新的希望。建立高效可靠的淤泥微生物總DNA提取方法，是進(jìn)行微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。

為了更好地進(jìn)行淤泥微生物基因組學(xué)的相關(guān)研究，研發(fā)一種方便、快捷的淤泥微生物基因組DNA提取試劑盒才能滿足日益發(fā)展的淤泥微生物基因組學(xué)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種基于磁珠法提取淤泥微生物基因組DNA的試劑盒，該試劑盒與常規(guī)的淤泥微生物基因組DNA提取方法相比更加方便、快捷。本試劑盒主要是利用硅基磁珠特異性吸附基因組DNA的原理研發(fā)而成的，能夠大規(guī)模的提取淤泥微生物基因組DNA，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

一種基于磁珠法提取淤泥微生物基因組DNA的試劑盒，包括淤泥微生物細(xì)胞的破碎、雜蛋白的抽除，磁珠法回收微生物基因組，具體步驟如下：

淤泥微生物細(xì)胞的破碎：稱取1-2g淤泥樣品于10ml離心管中，加入4-6ml?Buffer?A溶液，震蕩3-5min混勻，加入溶菌酶至終濃度為3-10mg/ml，震蕩5-10min混勻。37℃，225-300r/min搖床上震蕩1-2h，加入600-800μl?Buffer?B溶液，震蕩5-10min混勻后60-70℃水浴1-2h，期間每10-20min震蕩混勻1-2min，

雜蛋白的抽除：往溶液中加入4-5ml?Buffer?C，振蕩器震蕩30-60s后，12000-13000rpm/min離心10-20min，將上清移至新的離心管中，加入等體積的Buffer?D，12000-13000rpm/min離心10-20min，將上清移至新的離心管中。

磁珠法回收微生物基因組：加入等體積的Buffer?E。震蕩10-20s。室溫放置5-10min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入1-2ml?Buffer?F,打勻后室溫靜止5-10min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入50-100μl?Buffer?G，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取液體，此溶液即為淤泥微生物基因組DNA。于1％瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

所述的磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為1um。購買自溫州安科納米科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：AK1-G1000。

所述的Buffer?A：0.1-0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，0.1-0.2mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1-0.2mol/L磷酸鈉，1.5-2mol/L氯化鈉(Nacl)，1-2％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，PH＝7.0-9.0。

所述的Buffer?B:20-30％質(zhì)量體積比的十二烷基硫酸鈉(SDS)。

所述的Buffer?C:酚：氯仿：異戊醇的體積體積比為25:24:1。

所述的Buffer?D:氯仿：異戊醇的體積體積比為24:1。

所述的Buffer?E：異丙醇：磁珠混懸液的體積比為24:1，其中磁珠混懸液由磁珠和水按照1:2體積比配置。

所述的Buffer?F：4.3-21.4mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris),2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),42.9-85.7mmol/L?Nacl，60-80％無水乙醇。

所述的Buffer?G：8-10mmol/L?Tris三羥甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝8.0-9.0。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：