[發(fā)明專利]一種鼻咽癌相關(guān)EB病毒檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510447270.1
• 申請日: 2015-07-27
• 公開（公告）號: CN105039595A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔梁;張貽琛
• 申請（專利權(quán)）人: 慈溪市人民醫(yī)院;普生（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 天津市新天方有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12104
• 代理人: 張強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鼻咽癌相關(guān)EB病毒檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

EB病毒(EBV)在世界各地感染比較普遍，成人超過90％均曾感染過。EB病毒感染可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥，與Burkitt淋巴瘤、Hodgkin病和鼻咽癌(NPC)等密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)EBV感染與多種人類腫瘤發(fā)生相關(guān)。包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等。EBV在這些腫瘤發(fā)生中起到相當(dāng)重要的作用，因此在1997年已經(jīng)把EBV歸為第一類致癌物。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)血漿游離EBV-DNA是一種可靠的監(jiān)測指標(biāo)，對鼻咽癌的診斷、監(jiān)測療效及預(yù)后判斷等方面都起到很好的作用。檢測EBV-DNA含量對高危地區(qū)NPC患者進行篩查和和輔助診斷有很高的實用價值。

目前ELISA檢測EBV各項抗體是臨床診斷EBV感染的重要指標(biāo)之一，但它實際上檢測的是人體對EBV感染的免疫反應(yīng)狀態(tài)，無法檢測病毒自身，也就無法準(zhǔn)確靈敏地反映EBV感染的情況。由于鼻咽癌外周血循環(huán)的游離EBV-DNA的拷貝數(shù)隨著全身化療周期的進行而呈現(xiàn)動態(tài)變化，所以檢測鼻咽癌患者EBV-DNA的表達(dá)水平對判斷病灶殘留、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、判斷治療的敏感性、綜合治療方案的及時更改、確認(rèn)以及判斷療效、預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)意義，EBV目前已經(jīng)成為鼻咽癌診治中重要的血清分子標(biāo)志物，可以作為診斷和治療中的一項參考依據(jù)。

目前國外已經(jīng)上市的檢測EBV-DNA的試劑盒有幾種，檢測的方法主要是熒光免疫雜交(HIGH)，國內(nèi)檢測EBV主要采用ELISA方法，未見有批準(zhǔn)上市檢測EBV-DNA的試劑盒。基于EBV感染情況如此嚴(yán)重，開發(fā)一種簡單、易行、成本較低的檢測方法就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種鼻咽癌相關(guān)EB病毒檢測試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案：一種鼻咽癌相關(guān)EB病毒檢測試劑盒，該試劑盒含有：

(1)EB-PCR反應(yīng)液：包括buffer、dNTPs、taq酶；

(2)第一EB引物探針液：包括第一EB引物、第一EB探針；

(3)第二EB引物探針液；包括第二EB引物、第二EB探針；

(4)臨界陽性質(zhì)控品：為含有擴增目的基因片段的重組質(zhì)粒；

(5)陽性質(zhì)控品：為含有擴增目的基因片段的重組質(zhì)粒；

(6)陰性質(zhì)控品：DEPC水；

所述第一EB引物，序列如下：

正向引物：TACGCTTTGTTCCTTARA；

反向引物：GTCAGGATAGCAAGAATR；

所述第一EB探針，序列如下：

TTACTGATTGTCGCTGGCATACTCT；

由所述第一EB引物與第一EB探針擴增出的第一DNA序列為：TTACGCTTTGTTCCTTAGATTTGTTCTGCATGTTATTACTGATTGTCGCTGGCATACTCTTCATTCTTGCTATCCTGACCGAATG；

所述第二EB引物，序列如下：

正向引物：CTGGACACTTATGTTTCAA；

反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA；

所述第二EB探針，序列如下：

FAM-TATGGTCACTCAGGCACGGTC--BHQ1

由所述第二EB引物與第二EB探針擴增出的第二DNA序列為：CTGGACACTTATGTTTCAAGCAGCTCACCTATGGTCACTCAGGCACGGTCGCCCCTCCGAGTGACCAGTCACCTTCCAGACTATGCATACACTGAATTTAGCCTGATATTGTCCC；

本發(fā)明還提供一種利用上述試劑盒檢測鼻咽癌相關(guān)EB病毒的檢測方法：包括以下步驟：

(1)標(biāo)本提取：根據(jù)標(biāo)本的不同選擇不同的提取方式：咽拭子樣本、組織及鼻咽部石蠟切片，選擇相應(yīng)的試劑盒，按照其說明書和注意事項進行提取即可。EB病毒的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品無需抽提，使用前室溫融化混勻；

(2)試劑配置：

A、在試劑準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)將盒內(nèi)各組分取出，于室溫充分融化之后，短暫震蕩，瞬時離心，算加到反應(yīng)混合物中的量；

B、取1.5mL離心管配置反應(yīng)體系，試劑全部加入后震蕩混勻，瞬時離心；