[發明專利]一種鼻咽癌相關EB病毒檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201510447270.1
• 申請日: 2015-07-27
• 公開（公告）號: CN105039595A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 龔梁;張貽琛
• 申請（專利權）人: 慈溪市人民醫院;普生（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 天津市新天方有限責任專利代理事務所 12104
• 代理人: 張強

1.一種鼻咽癌相關EB病毒檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有：

(1)EB-PCR反應液：包括buffer、dNTPs、taq酶；

(2)第一EB引物探針液：包括第一EB引物、第一EB探針；

(3)第二EB引物探針液；包括第二EB引物、第二EB探針；

(4)臨界陽性質控品：為含有擴增目的基因片段的重組質粒；

(5)陽性質控品：為含有擴增目的基因片段的重組質粒；

(6)陰性質控品：DEPC水；

所述第一EB引物，序列如下：

正向引物：TACGCTTTGTTCCTTARA；

反向引物：GTCAGGATAGCAAGAATR；

所述第一EB探針，序列如下：

TTACTGATTGTCGCTGGCATACTCT；

由所述第一EB引物與第一EB探針擴增出的第一DNA序列為：

TTACGCTTTGTTCCTTAGATTTGTTCTGCATGTTATTACTGATTGTCGCTGGCATACTCTTCATTCTTGCTATCCTGACCGAATG；

所述第二EB引物，序列如下：

正向引物：CTGGACACTTATGTTTCAA；

反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA；

所述第二EB探針，序列如下：

FAM-TATGGTCACTCAGGCACGGTC--BHQ1；

由所述第二EB引物與第二EB探針擴增出的第二DNA序列為：

CTGGACACTTATGTTTCAAGCAGCTCACCTATGGTCACTCAGGCACGGTCGCCCCTCCGAGTGACCAGTCACCTTCCAGACTATGCATACACTGAATTTAGCCTGATATTGTCCC。

2.權利要求1所述的一種鼻咽癌相關EB病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)標本提取：根據標本的不同選擇不同的提取方式：咽拭子樣本、組織及鼻咽部石蠟切片，選擇相應的試劑盒，按照其說明書和注意事項進行提取即可，EB病毒的陽性質控品、陰性質控品和臨界陽性質控品無需抽提，使用前室溫融化混勻；

(2)試劑配置：

A、在試劑準備區內將盒內各組分取出，于室溫充分融化之后，短暫震蕩，瞬時離心，算加到反應混合物中的量；

B、取1.5mL離心管配置反應體系，試劑全部加入后震蕩混勻，瞬時離心；

C、將上述混合液17μL/管分裝至PCR反應管中，將陰性質控品、臨界陽性質控品、定量標準品和已處理樣本的提取產物8μL分別加入PCR反應管中，蓋緊管蓋，瞬時離心將管壁上的液體全部甩至管底，然后立即進行PCR擴增反應；

(3)PCR擴增：

將各反應管放入熒光定量PCR儀器中，設置標記熒光基團種類、樣本名稱及類型，按下列條件進行擴增：

預變性94℃4分鐘1個循環

變性94℃15秒45個循環

退火、延伸、熒光信號采集60℃45秒45個循環；

(4)分析判斷：

樣品Ct值小于35，則表示為EB病毒感染陽性；樣品的樣品Ct值在35到38之間，FAM通道有比較明顯的S型擴增曲線則要對樣品進行復檢；樣品的樣品Ct值大于38，則意味EB病毒載量低于檢測下限。