[發明專利]STIM1蛋白在相關疾病風險診斷中的應用

有效

• 申請號: 201510447265.0
• 申請日: 2015-07-27
• 公開（公告）號: CN105203770B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 劉杰;董鳴
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京睿派知識產權代理事務所(普通合伙)11597
• 代理人: 劉鋒

1.STIM1蛋白在診斷缺血性腦卒中風的藥物的制備中的用途，其中所述診斷包括疾病嚴重程度的診斷和/或疾病預后恢復的診斷，所述診斷通過測定外周血中血小板內STIM1蛋白的含量進行。

2.如權利要求1所述的用途，其中所述診斷通過酶聯免疫定量檢測試劑盒進行檢測。

3.如權利要求1所述的用途，其中所述藥物中包含所述STIM1蛋白的抗體。

4.如權利要求3所述的用途，其中所述藥物中包含捕獲抗體A和/或酶標檢測抗體B。

5.如權利要求4所述的用途，其中所述藥物包括試劑盒。

6.如權利要求5所述的用途，其中所述試劑盒為酶聯免疫試劑盒。

7.一種酶聯免疫試劑盒在診斷缺血性腦卒中風的藥物的制備中的用途，其中所述診斷包括疾病嚴重程度的診斷和/或疾病預后恢復的診斷，所述診斷通過測定外周血中血小板內STIM1蛋白的含量進行，所述試劑盒包含所述STIM1蛋白的捕獲抗體A和所述STIM1蛋白的酶標檢測抗體B，所述試劑盒還包括：包被緩沖液，0.1M 碳酸鹽緩沖液 CB，pH 值為 9.6 ；稀釋液，0.01mM 磷酸鹽緩沖液 PBS，pH 值為 7.4 ；洗滌液，含 0.2％吐溫-20 的 PBS ；封閉液含1%BSA的CB；和終止液，2M的H₂SO₄。

8.如權利要求7所述的用途，其中所述捕獲抗體A和所述酶標檢測抗體B通過以下方法制備：

（1）單克隆細胞制備：將表達純化的所述STIM1蛋白與等體積的弗氏佐劑、YOULONG佐劑混合乳化均勻，成油包水狀態，免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，間隔4周，最后經ELISA檢測；最后一次免疫后兩周，腹腔注射抗原進行加強免疫，三天后，將小鼠處死，得到脾細胞，加入SP2/0骨髓瘤細胞，在PEG4000的作用下進行細胞融合；將融合好的細胞鋪進96孔板，用HAT培養液進行培養，三天后用HT培養液培養，10天后，取細胞培養上清進行檢測得到陽性孔；使用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，10天后檢測，將陽性克隆繼續有限稀釋法進行克隆化，直到得到的克隆都為陽性，從而建立不少于50株陽性細胞株；

（2）單克隆抗體制備與純化：在小鼠腹腔注射礦物油，一周后將所獲得的陽性細胞株細胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水；于4000rpm室溫離心腹水15 min，取上清，在4℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續攪拌30 min，于13000rpm，4 ℃離心30 min，棄上清；將沉淀溶于0.01M, pH7.4的PBS；在4℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33%，繼續攪拌30 min，于13000rpm，4℃離心30 min，棄上清；沉淀溶于0.01M, pH7.4的PBS，4℃透析過夜；

（3）配對篩選：將純化后的單克隆抗體作為包被抗體，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液按照1:100倍稀釋，100μL/孔加至多孔板，4℃包被過夜；含 0.2％吐溫-20 的 PBS作為洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 uL，時間為1min，用PH9.6的碳酸鹽緩沖液按照1:9倍稀釋10%羊血清進行封閉，每孔150μL，恒溫37℃封閉3小時；加入濃度梯度為1000、100、10、0ppb的STIM1蛋白溶液，加入陰性對照，100μL /孔，25℃，溫育45 min；洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 uL，時間為1min；將得到的單克隆抗體逐一常規標記辣根過氧化物酶作為檢測抗體，用稀釋液按1：1000比例稀釋，充分混勻，每孔100 μl，25 ℃，溫育45 min；洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 μL，時間為1 min，每孔加TMB 100μL，25℃反應15 min；加入2M的H₂SO₄，100μL /孔，450 nm讀取吸光度值，選擇結合信號最強的一對包被抗體和檢測抗體分別作為用于所述試劑盒的所述捕獲抗體A和所述酶標檢測抗體B。