[發明專利]一株高效轉化富馬酸生產L-天冬酰胺的工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201510445371.5
• 申請日: 2015-07-27
• 公開（公告）號: CN105154379A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 程池;張奇;徐友強;裴疆森;李金霞;劉波
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一株基因工程菌及其應用，以富馬酸和氨水為底物一步法轉化生產l-天冬酰胺，屬于生物工程技術領域。

背景技術

l-天冬酰胺，又名天門冬酰胺、天門冬素、α-氨基丁二酸一酰胺（L-Asparagine，l-Asn），在食品、醫藥、化工合成等行業得到廣泛應用。

在食品領域，l-天冬酰胺作為添加劑，與糖共熱進行氨基-羰基反應，能形成特殊香味物質。用于清涼飲料。在醫藥行業，可以用于氨基酸輸液及降壓、平喘、抗消化性潰瘍、胃功能障礙等，在生命科學領域研究中，常用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導阻滯、疲勞等癥，在微生物培養中也有添加。工業領域l-天冬酰胺可以用于醫藥中間體及化工原料進行合成化工，也可用于丙烯腈的污水處理等。

目前，l-天冬酰胺的制備方法主要是提取法和化學合成法。直接提取方法主要是從l-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分離而得，以白羽扇豆為原料，經發芽、成漿、加熱處理等流程，在pH小于6的條件下，經硅藻土過濾、離心，獲得粗品，隨后經過濃縮、結晶獲得成品，該方法受原材料質量因素影響大，并且工藝復雜不易控制，污染嚴重；化學合成法主要通過l-天冬氨酸與氫氧化銨進行酰胺化而得，化學方法存在普遍的污染大、副反應多等缺陷。

生物轉化法在天冬酰胺生產領域的應用鮮有報道，雖然該方法具有反應條件溫和、生產效率高、副產物少等優點，同時對設備的要求低、投資小、生產過程簡單，易于操作控制，但是由于酶法催化過程需要ATP的參與，因ATP價格昂貴限制了生物轉化法的應用，目前未進入產業化階段。

發明內容

本發明提供一株可以同時產生l-天冬氨酸酶和l-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S，利用菌體細胞ATP再生體系，轉化富馬酸和氨水生產l-天冬酰胺，以替代現有l-天冬酰胺生產工藝，實現綠色生產。

本發明成功實現了將asnA基因在攜帶l-天冬氨酸酶基因的E.coliCICC11022S（等同于CMGCCNo.5450）宿主菌中的高效表達，并以此基因工程菌株轉化富馬酸和氨水生產l-天冬酰胺，具有原料成本低、生產過程簡易、簡便高效等特點（附圖1）。

本發明底物富馬酸、中間產物l-天冬氨酸及終產物l-天冬酰胺的定量測定分析采用柱前衍生-高效液相色譜方法（HenderJW,etal.,Rapid,accurate,sensitiveandreproducibleHPLCanalysisofaminoacids.AgilentTechnologies.USA.2000）。

本發明具有的突出特點是：

（1）本發明應用同時表達l-天冬酰胺合成酶和l-天冬氨酸酶的E.coli11022S/pET28a(+)-asnACICC11033S菌株轉化富馬酸和氨水生產l-天冬酰胺。

（2）本發明方法成功降低了原料的成本。

（3）本發明方法構建的基因工程菌生產l-天冬酰胺的過程簡便，易于操作。

（4）本發明的基因工程菌生產l-天冬酰胺，轉化率為94.7%，產量可達125.1g/L，生產速率12.51g/(L·h)。

附圖說明

圖1工程菌CICC11033S轉化富馬酸生產l-天冬酰胺示意圖。

圖2工程菌CICC11033S全細胞高密度催化生產l-天冬酰胺。

具體實施方式

實施例1.菌株E.coli11022S/pET28-asnA的構建