[發明專利]一株組成型表達基因工程菌及其生產L-丙氨酸的應用

在審

• 申請號: 201510443373.0
• 申請日: 2015-07-27
• 公開（公告）號: CN105018405A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發明（設計）人: 程池;徐友強;裴疆森;張奇;馬玉岳;姜增妍
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院;煙臺恒源生物股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一株基因工程菌及其應用，尤其涉及一株生產L-丙氨酸的基因工程菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-丙氨酸，又名L-α-氨基丙酸（L-Alanine，L-Ala），是生物體內與糖代謝密切相關、需求量較多的氨基酸之一。隨著研究和開發的深入，L-丙氨酸在食品和醫藥行業得到廣泛應用。

食品行業：L-丙氨酸作為添加劑，可明顯提高飲料中蛋白質的利用率，同時由于可被細胞直接吸收，飲用后能迅速消除疲勞、振奮精神。L-丙氨酸甜味柔和，甜度為蔗糖的70%，能夠提高甜度，可用于改善人工甜味劑味感和有機酸的酸味，使其味道更加自然。L-丙氨酸與谷氨酸鈉的復合調味品，可明顯改善食品風味。L-丙氨酸是合成甜味劑阿力甜的主要原料，其甜度是蔗糖的2000倍左右，目前已在多個國家和地區獲準使用。

醫藥行業：L-丙氨酸是合成維生素B₆和氨基丙醇（鹽酸左氧氟沙星合成前提）的重要中間體，也是營養劑補糖氨基酸營養輸液的組分之一。L-丙氨酸也是血液保存劑的主要成分，可提高血液保存期。

目前，廣泛使用的L-丙氨酸生產方法為微生物轉化法，通過L-天冬氨酸-β-脫羧酶催化L-天冬氨酸脫羧基反應，生產L-丙氨酸，具有反應條件溫和、生產效率高、副產物少等特點，同時對設備的要求低、投資小、生產過程簡單、易于操作控制，但是該轉化過程生產成本相對較高。

L-天冬氨酸微生物轉化生產是利用微生物產生的L-天冬氨酸酶，轉化底物富馬酸和氨水獲得的（附圖1）。富馬酸來源廣泛，價格低廉。

本發明在一個工程菌株中實現L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶的共表達，以富馬酸和氨水為底物生產L-丙氨酸，可以有效降低原料成本，同時在富馬酸轉化時反應體系中富余的NH₃可以與L-天冬氨酸脫羧產生的CO₂發生中和反應，產生副產品碳酸銨，進而進一步降低成本。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的菌株品種，可以同時產生L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶，轉化富馬酸生產L-丙氨酸，以替代現有L-丙氨酸生產工藝的原料L-天冬氨酸，降低生產成本。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。

一、本發明的基因工程菌株，是以可以產生L-天冬氨酸酶的大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）CICC?11022S（等同于CGMCC?No.?5450）作為出發菌株，通過將L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因（如asd基因）導入該菌株并表達，構建而成的重組菌株CICC?11032S。

進一步的，該基因工程菌株構建步驟如下：

(1)?人工合成tac啟動子，其序列如SEQ?ID?NO.?2所示。

(2)?以上述合成的tac啟動子為模板，設計引物如下：

tac.f:?5’-TTAACGCGTATCACTGCATAATTCGTG-3’?(劃線部分是MluI核酸內切酶酶切位點)；

tac.r:?5’-TTATCTAGATCCACACATTATACGAGC-3’?(劃線部分是XbaI核酸內切酶酶切位點)。

(3)?以上述引物進行tac啟動子的擴增，并用相應的核酸內切酶酶切處理擴增的DNA片段和載體pET28a（購自Novagen公司，其核酸序列如SEQ?ID?NO.?3所示），DNA連接酶連接，獲得重組質粒，命名為pETP_tac。

(4)?提取睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas?testosteroni）CICC?11023s（等同于CGMCC?No.?6083）基因組，以基因組為模板，擴增L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因，設計引物如下：

asd.f:?5’-?GGCATATGATGAGCAAGGATTATCAG?-3’?(劃線部分是NdeI核酸內切酶酶切位點)；

asd.r:?5’-ATTCTCGAGTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3’?(劃線部分是XhoI核酸內切酶酶切位點)。