[發明專利]一種中華鱉源膠原蛋白的純化方法

在審

• 申請號: 201510428672.7
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN105039480A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 李彩燕;楊椏楠;錢國英;宋偉
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/30
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平

技術領域

本發明涉及一種中華鱉源膠原蛋白的純化方法，屬于天然活性物質領域。

背景技術

膠原蛋白是生物體內重要的結構蛋白，是支持組織和結締組織的主要組成部分。膠原蛋白所特有的三重螺旋的氨基酸結構使它具有許多很有用的特性，如高拉伸強度、良好的生物相容性、低抗原性、低刺激性和低細胞毒性以及促進細胞生長的性能。所具有的這些特性都使其成為一種理想的生物醫用材料。以膠原蛋白為原料所衍生的生物醫用材料，已成為醫用材料領域最快的增長點之一，全球市場年銷售額已達40余億美元。

傳統提取膠原蛋白所使用的原料主要來自豬和牛等動物的皮膚等結締組織。但由于瘋牛病、禽流感、口蹄疫等問題，國家對動物組織來源的膠原蛋白產品實行嚴格控制，我國政府目前禁止所有以牛的組織為原料提取的進口膠原蛋白產品。尋找新來源的生物膠原蛋白是當前急需要解決的重要課題。與陸生動物相比，水產動物膠原即使在低溫下也可溶于中性鹽溶液或酸性溶液，比較容易制得可溶性膠原溶液，這為其利用提供了有利條件。

目前人們已經從多種水產品中提取到了膠原蛋白，相關報道也越來越多。但對于我國傳統的營養滋補佳品，本身就富含膠原蛋白的水產動物——中華鱉作為新型生物膠原蛋白來源的研究卻比較缺乏。中華鱉(Pelodiscussinensis)，俗稱甲魚，自古就是我國傳統的滋補佳品，具有很高的營養價值和保健功效。鱉甲周圍的結締軟組織通常被稱為“裙邊”，膠原蛋白含量十分豐富，經前期實驗表明，其干重含量超過70％，經文獻檢索，關于中華鱉中膠原蛋白的研究僅限于其分離提取及結構表征的報道，但關于鱉源膠原蛋白的純化工藝及生物學性能研究則未見報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術提供一種純化工藝簡單的中華鱉源膠原蛋白的純化方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)浸泡：取中華鱉裙邊勻漿打碎，用堿性浸泡鹽液中于4℃～10℃下放置24h～48h，蒸餾水反復洗滌，用紗布充分瀝干后備用；

(2)去脂肪：將步驟(1)浸泡后，他材料搜集好了再給我10％～15％異丙醇溶液于4℃～10℃浸泡24h～48h，以去除脂肪，蒸餾水反復洗滌，用紗布充分瀝干后備用；

(3)酶解：將已去雜的中華鱉裙邊置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中進行酶解處理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中華鱉裙邊膠原蛋白粗提液；

(4)鹽析純化：取步驟(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl緩沖液中，離心取上清液，加入NaCl至上清液中，鹽析，再次離心，分別收集沉淀和上清液；將沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷凍干燥，即得中華鱉膠原蛋白凍干品。

進一步地，所述步驟(4)的鹽析純化過程中分別研究了時間、NaCl濃度、膠原蛋白濃度三個因素對膠原蛋白回收率的影響，其中，針對時間因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，均稀釋粗提液膠原蛋白濃度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下鹽析1h、12h、24h、36h、48h；而針對NaCl濃度因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，分別加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L的NaCl，在4℃下鹽析24h；而針對膠原蛋白濃度因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，分別稀釋粗提液膠原蛋白濃度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下鹽析24h。本發明的研究重點在于首次研究了膠原蛋白濃度對于分離純化所起的作用，為其它純化實驗不常用的一個因素，原因在于：膠原蛋白濃度太高就會造成聚沉，需要有一個最佳鹽析范圍，中性鹽沉淀蛋白質時，溶液中蛋白質的實際濃度對分離的效果有較大的影響，同時還綜合了時間和NaCl濃度兩個因素，以通過對時間、NaCl濃度、膠原蛋白濃度三個因素的研究，以確定最佳的分離純化效果。

作為優選，所述鹽析的最佳組合為：時間為24h、NaCl濃度為3mol/L，膠原蛋白濃度為8g/L。

進一步地，所述步驟(4)的透析過程具體為：將所述沉淀溶解于乙酸后，用截留分子量分別為25KD、50KD、100KD的透析袋進行透析，透析液為純水，在4℃～10℃下分別透析24h和48h，透析期間換水4～5次，取各透析時間的膠原蛋白溶液進行SDS-PAGE檢測純度，將透析后的膠原蛋白溶液冷凍干燥得膠原蛋白凍干品。