[發明專利]一種中華鱉源膠原蛋白的純化方法

在審

• 申請號: 201510428672.7
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN105039480A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 李彩燕;楊椏楠;錢國英;宋偉
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/30
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平

1.一種中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)浸泡：取中華鱉裙邊勻漿打碎，用堿性浸泡鹽液中于4℃～10℃下放置24h～48h，蒸餾水反復洗滌，用紗布充分瀝干后備用；

(2)去脂肪：將步驟(1)浸泡后的中華鱉裙邊進行清洗，加入10％～15％異丙醇溶液于4℃～10℃浸泡24h～48h，以去除脂肪，蒸餾水反復洗滌，用紗布充分瀝干后備用；

(3)酶解：將已去雜的中華鱉裙邊置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中進行酶解處理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中華鱉裙邊膠原蛋白粗提液；

(4)鹽析純化：取步驟(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl緩沖液中，離心取上清液，加入NaCl至上清液中，鹽析，再次離心，分別收集沉淀和上清液；將沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷凍干燥，即得中華鱉膠原蛋白凍干品。

2.根據權利要求1所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述步驟(4)的鹽析純化過程中分別研究了時間、NaCl濃度、膠原蛋白濃度三個因素對膠原蛋白回收率的影響，其中，針對時間因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，均稀釋粗提液膠原蛋白濃度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下鹽析1h、12h、24h、36h、48h；而針對NaCl濃度因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，分別加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L的NaCl，在4℃下鹽析24h；而針對膠原蛋白濃度因素的研究方法為：取10mL的所述粗提液，分別稀釋粗提液膠原蛋白濃度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下鹽析24h。

3.根據權利要求2所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述鹽析的最佳組合為：時間為24h、NaCl濃度為3mol/L，膠原蛋白濃度為8g/L。

4.根據權利要求1所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述步驟(4)的透析過程具體為：將所述沉淀溶解于乙酸后，用截留分子量分別為25KD、50KD、100KD的透析袋進行透析，透析液為純水，在4℃～10℃下分別透析24h和48h，透析期間換水4～5次，取各透析時間的膠原蛋白溶液進行SDS-PAGE檢測純度，將透析后的膠原蛋白溶液冷凍干燥得膠原蛋白凍干品。

5.根據權利要求1所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述堿性浸泡鹽液的用量為所述中華鱉裙邊質量的2倍～4倍。

6.根據權利要求5所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述堿性浸泡鹽液中含有NaCl和NaOH，所述堿性浸泡鹽液中NaCl的質量分數為2％～4％，所述堿性浸泡鹽液中NaOH的濃度為0.5％～1.5％。

7.根據權利要求1所述的中華鱉源膠原蛋白的純化方法，其特征在于：所述步驟(3)中酶解處理的溫度為30℃～50℃，酶解處理的pH值為2～4，酶解處理的時間為8h～12h。