[發明專利]一種大腸桿菌中融合熒光蛋白質的制備方法

有效

• 申請號: 201510426302.X
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN105018552B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 陳華新;武靜;姜鵬;趙瑾
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/70;C12N15/62
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

本發明屬于生物技術中熒光蛋白質和重組抗體領域，具體的說是涉及一種大腸桿菌中融合熒光蛋白質的制備方法。制備方法是將AFP單鏈抗體基因和別藻藍蛋白α亞基基因通過linker序列拼接成嵌合基因，并將該嵌合基因、藻膽蛋白裂合酶基因和藻膽色素生物合成酶基因在大腸桿菌中共表達，獲得共價結合藻紅膽素的融合熒光蛋白質或共價結合藻藍膽素的融合熒光蛋白。本發明是利用生物技術方法在大腸桿菌體內生產單鏈抗體和別藻藍蛋白α亞基融合蛋白，是一種環境友好、成本低的制備方法。該融合蛋白可用于生物學和生物醫學檢測等領域。

技術領域

本發明屬于生物技術中熒光蛋白質和重組抗體領域，具體的說是涉及一種大腸桿菌中融合熒光蛋白質的制備方法。

背景技術

藻膽蛋白是藻類重要的色素蛋白，具有光能捕獲和傳遞的作用。每分子的藻膽蛋白含有兩條結構相似的多肽鏈α和β，α亞基和β亞基分別含有約160～180個氨基酸殘基，二者的比例通常為1:1。亞基中的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵與藻膽色素共價結合，藻膽色素的種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定了藻膽蛋白的光譜學性質。根據吸收光譜的不同，可將藻膽蛋白分為4大類：即藻紅蛋白PE,λ_max＝540nm～570nm，藻紅藍蛋白PEC，λ_max＝567nm，藻藍蛋白PC，λ_max＝615nm～640nm和別藻藍蛋白APC，λ_max＝650nm～655nm。

藻膽蛋白能發出強烈的熒光，其熒光特性最重要的用途是在免疫診斷用熒光標記、生物醫學研究等方面，可將其與生物素、親和素或各種抗體結合制成熒光探針，用于免疫熒光分析和檢測等工作中。

在免疫熒光分析中，藻膽蛋白作為熒光標記物需要與抗體結合，即通過雙功能試劑將藻膽蛋白分子與抗體分子共價交聯，或通過生物素·親和素系統(BAS)將藻膽蛋白分子間接耦聯到抗體分子上。無論通過何種方式標記，都需要分別制備藻膽蛋白和抗體。藻膽蛋白與抗體通過化學交聯劑直接交聯，可能會降低抗體活性和藻膽蛋白的熒光強度。而通過生物素·親和素系統，則需要將藻膽蛋白和鏈霉親和素通過化學交聯的方式偶聯起來，抗體則需要經過生物素化處理。因此，藻膽蛋白和抗體無論是通過直接交聯還是通過BAS系統間接偶聯，過程均較復雜，制備的成本很高。簡化制備步驟，降低生產成本，將有助于拓展藻膽蛋白熒光探針的應用。

單鏈抗體是一種小分子抗體，它由一段彈性連接鏈把抗體重鏈可變區與輕鏈可變區相連而成，是具有親代抗體全部抗原結合特異性的最小功能結構單位。它具有分子量小，只有完整抗體分子的1/6，能以單價的形式結合特異性抗原，免疫原性低，組織穿透力強，可以利用基因工程方法進行異源表達，從而降低生產成本。

發明內容

本發明目的在于提供一種大腸桿菌中融合熒光蛋白質的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種大腸桿菌中融合熒光蛋白質的制備方法：將AFP單鏈抗體基因和別藻藍蛋白α亞基基因通過linker序列拼接成嵌合基因，并將該嵌合基因、藻膽蛋白裂合酶基因和藻膽色素生物合成酶基因在大腸桿菌中共表達，獲得共價結合藻紅膽素的融合熒光蛋白質或共價結合藻藍膽素的融合熒光蛋白；

所述藻膽色素為藻紅膽素或藻藍膽素。

具體是：

1)利用融合PCR，將AFP單鏈抗體基因，linker序列和別藻藍蛋白亞基基因連接形成嵌合基因，將該嵌合基因插入到大腸桿菌表達載體pCDFDuet-1的一個表達框中；將裂合酶基因cpcS插入到該表達載體的另一個表達框中；

2)將藻紅膽素生物合成酶基因Ho1和pebS，分別插入到另一個表達載體pRSFDuet-1的兩個表達框中；

3)將兩個構建好的表達載體同時轉化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；