[發明專利]沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測方法

在審

• 申請號: 201510424719.2
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN104946782A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 俞超;胡茂秀;王莎莎
• 申請（專利權）人: 青島康倫生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京中北知識產權代理有限公司 11253
• 代理人: 段秋玲

1.用于沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測的引物，其特征在于，包括：

(1)具有SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8所示的核苷酸序列；或

(2)與(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。

2.采用權利要求1所述引物對沙門菌和大腸桿菌O78的雙重Tem-PCR快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)設計和合成引物；所述引物包括超級引物Fs和Rs、擴增沙門菌的外引物invA-F0和invA-R0、內引物invA-Fi和invA-Ri以及擴增大腸桿菌O78的特異性的內引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；

擴增沙門菌的外引物invA-F0和invA-R0、內引物invA-Fi和invA-Ri以及擴增大腸桿菌O78的特異性的內引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8所示的核苷酸序列；

(2)樣品DNA模板制備；包括：

a)取沙門菌或大腸桿菌O78的菌液1mL于12000r/min離心5min；沉淀加入100μL無菌水，混勻后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min離心5min，上清液即為DNA模板；或

b)取1g新鮮雞糞加入5mL?LB液體培養基，37℃，200rpm，增菌5h；低速離心5min；取1mL上清，12000rpm離心5min，棄上清，加入100μL?ddH₂O懸浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min；12000rpm離心3min，上清即為DNA模板；或

c)取奶粉5g加入100mL?LB液體培養基中，高壓滅菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀釋的沙門菌和大腸桿菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm離心5min，棄上清，加入100μL?ddH₂O懸浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm離心3min，上清即為DNA模板；或

d)取10⁷cfu/mL的沙門菌和大腸桿菌O78用滅菌化妝水10倍比梯度稀釋，分別取不同濃度的化妝水稀釋菌液100uL加入900uL?LB液體培養基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制備DNA模板；

(3)雙重Tem-PCR擴增反應；所述雙重Tem-PCR擴增反應是以步驟(2)提取的DNA作為模板，采用雙重Tem-PCR法進行擴增，擴增體系和反應條件如下：

2×PCR?buffer?2μL，0.4mM?dNTP，外引物invA-F0和invA-R0以及O78-F0和O78-R0各0.04μM，內引物invA-Fi和invA-Ri以及O78-Fi和O78-Ri各0.16μM，Fs和Rs各0.4μM，DNA聚合酶1U，MgCl₂2mM，DNA模板1.0μL，ddH₂O補足20μL；PCR擴增條件為：94℃，10min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，10個循環；94℃15s，72℃90s，3個循環；94℃15s，56℃15s，72℃30s，25個循環；最后72℃后延伸5min；

(4)將PCR擴增反應產物進行瓊脂糖電泳檢測；將5μL所述擴增反應產物用1％瓊脂糖電泳分離，根據條帶有無和大小判定結果。

3.根據權利要求2所述的雙重Tem-PCR快速檢測方法，其特征在于，所述MgCl₂的濃度為2～3mM。

4.根據權利要求2所述的雙重Tem-PCR快速檢測方法，其特征在于，所述dNTP的濃度為0.2～0.5mM。

5.根據權利要求2所述的雙重Tem-PCR快速檢測方法，其特征在于，所述外引物的濃度從0μM到0.1μM；內引物的濃度從0.1μM到0.2μM。

6.根據權利要求2所述的雙重Tem-PCR快速檢測方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為Taq酶，濃度為1.0～3.0U。