[發明專利]沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測方法

在審

• 申請號: 201510424719.2
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN104946782A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 俞超;胡茂秀;王莎莎
• 申請（專利權）人: 青島康倫生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京中北知識產權代理有限公司 11253
• 代理人: 段秋玲

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測方法與應用。

背景技術

快速檢測與鑒定致病性病原菌是及時有效的預防和控制病原菌傳播的前提，對于畜禽業的健康正常發展以及食品的檢驗檢疫安全和人類健康具有重要意義。

目前食品衛生微生物學檢驗(GB/T?4789.1—2003)病原菌仍主要依靠傳統的細菌培養、血清學、生化鑒定等方法，檢測周期長(需4～7d)，操作繁瑣復雜，特異性、敏感度均較低，不能適應快速檢測的需要。隨著以核酸為基礎的分子微生物檢測技術的發展，特別是聚合酶鏈反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)技術的應用，使病原菌診斷技術發展到一個新的水平。PCR技術能夠快速、靈敏地進行檢測，并且已經在微生物檢測方面獲得了極為廣泛的應用。后來，酶聯熒光免疫檢測法、金標試紙法、DNA探針技術、LAMP恒溫擴增法等都逐漸出現在病原微生物檢測領域。

目前的畜禽養殖都是規模化養殖，密度大，病原菌感染后傳播快，而傳統的病原菌檢測方法操作繁瑣，耗時耗力，不能起到有效地監測和預防作用，也很難指導發病后的合理用藥。而目前對致病菌的檢測方法如國標法、酶聯熒光免疫檢測法、聚合酶鏈式反應(PCR)、金標試紙法、DNA探針技術、LAMP恒溫擴增法,這些方法都有存在不足之處，即檢測通量不高。

多重PCR方法是提高檢測通量的基本方法，可以在同一PCR體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段。不僅可以縮短檢測時間，尤其適用于多種病原微生物同時存在的樣品及復雜生態環境下的病原微生物檢測方面。但多重PCR技術由于存在擴增偏好性,常常出現擴增效率不均衡問題，降低檢測靈敏度甚至造成假陰性結果。

發明內容

本發明針對多重PCR存在的問題，采用靶序列富集多重PCR(target?enriched?multiplex?PCR，Tem-PCR)技術，它的原理是針對待擴增的每一種靶序列，設計特異性引物，再編制一個通用引物(SuperPrimer)與之相聯，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)進行擴增。其獨特之處在于嵌合引物的濃度極低，用在PCR的最初幾個循環中富集目標序列。只有超級引物的濃度足以進行指數擴增，這樣克服多重PCR的擴增偏愛性問題，可將傳統多重PCR檢測靈敏度提高2-3個數量級,解決了傳統的多重PCR技術導致的假陰性結果問題。

本發明要解決的技術問題是提供用于沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測的引物。

本發明要解決的另外一個技術問題是提供一種沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測方法。

對于用于沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測的引物，本發明采用的技術方案是，包括：

(1)具有SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8所示的核苷酸序列；或

(2)與(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。

對于沙門菌和大腸桿菌O78雙重Tem-PCR快速檢測方法，本發明采用的技術方案是包括以下步驟：

(1)設計和合成引物；所述引物包括超級引物Fs和Rs、擴增沙門菌的外引物invA-F0和invA-R0、內引物invA-Fi和invA-Ri以及擴增大腸桿菌O78的特異性的內引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；

擴增沙門菌的外引物invA-F0和invA-R0、內引物invA-Fi和invA-Ri以及擴增大腸桿菌O78的特異性的內引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8所示的核苷酸序列；

(2)樣品DNA模板制備；包括：

a)取沙門菌或大腸桿菌O78的菌液1mL于12000r/min離心5min；沉淀加入100μL無菌水，混勻后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min離心5min，上清液即為DNA模板；或