[發明專利]表面活性劑包衣菌體催化合成共軛亞油酸異構體的方法

有效

• 申請號: 201510423890.1
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN105087691B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 劉曉華;李海星
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N11/04;C12R1/245
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA) 是一組十八碳共軛二烯酸的統稱，共軛雙鍵有4種位置異構（8,10; 9,11; 10,12; 11,13）和4種幾何異構（cis,cis; cis,trans; trans,cis; trans,trans），共有多達16種異構體，如：c9,t11-CLA和t10,c12-CLA異構體等。研究發現CLA具有抗癌、預防動脈粥樣硬化、增強機體免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越來越多的研究表明其生理活性具有異構體特異性，現在普遍認為c9,t11-CLA異構體具有抗癌和預防動脈粥樣硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反芻動物的奶和肉中的脂肪中，主要由c9,t11-CLA和少量t9,t11-CLA，t10,c11-CLA等異構體構成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，無法滿足以保健和醫療為目的的開發應用。

為實現CLA異構體的大量制備，人們已對微生物發酵制備CLA進行了較多研究。目前，微生物發酵均在水溶液中進行，由于所加的發酵底物—亞油酸是脂溶性物質，因此亞油酸加入發酵液前需經乳化處理，且添加量受到限制，從發酵液中獲得CLA產物需經有機溶劑萃取，整個生產工藝存在發酵周期長、生產成本高、產量低的缺點。發明專利CN201110105610提出了一種植物乳桿菌生物轉化共軛亞油酸的方法，底物添加量為25mg/mL，發酵時間長達120h，CLA的產量只有1.02mg/mL，底物的轉化率只有4%。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提出一種表面活性劑包衣菌體催化合成共軛亞油酸異構體的方法，顯著縮短合成時間、提高產量和轉化率、降低生產成本。

本發明包括以下步驟。

（1）菌體的透性化處理：收集處于對數生長期的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌體，按每克濕菌體重懸于5mL透性化處理液中計，將濕菌體重懸于透性化處理液中（所述的透性化處理液含體積百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，20-200mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液），重懸菌體經37℃處理20min，離心收集透性化菌體。

（2）菌體包衣處理：透性化菌體用60mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液洗滌后，離心收集菌體，按每克濕菌體重懸于20mL60mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液中計，將透性化濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，再向其中滴加表面活性劑溶液（所述的表面活性劑溶液為含質量百分比1%谷氨酸雙油醇酯核糖醇的丙酮溶液），邊加邊混合均勻，于4-40℃處理2-6h，離心收集菌體，將菌體冷凍干燥后得到包衣菌體。

（3）催化合成：按每克凍干包衣菌體加入到500mL正己烷中計，將包衣菌體加入到正己烷中，攪拌均勻，加入正己烷體積百分比0.1-0.3%的亞油酸，在4-40℃下反應1-12h。

（4）產物收集：離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進行減壓蒸餾，回收正己烷，產物為c9,t11-共軛亞油酸異構體。

本發明所述的步驟（1）中透性化處理液優選為含體積百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，30-100mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液。

本發明所述的步驟（2）中表面活性劑溶液的滴加量優選為每50mL菌懸液加入5-15mL表面活性劑溶液。

本發明所述的步驟（2）中處理溫度優選為4-25℃。

本發明所述的步驟（2）中處理時間優選為3-5h。

本發明所述的步驟（3）中優選加入正己烷體積百分比0.125-0.25%的亞油酸，在15-30℃下反應2-6h。

本發明所述的步驟（4）中包衣菌體可重復用于催化合成c9,t11-共軛亞油酸異構體。