[發明專利]5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法

在審

• 申請號: 201510421000.3
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105039309A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 秦偉;林碩;李松
• 申請（專利權）人: 深圳市盛捷生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 生啟

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法。

背景技術

近年來鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases)以及轉錄激活因子樣效應物核酸酶TALENs(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)等基因組編輯技術使得人們精確修飾基因組成為可能。在識別基因組上的DNA位點時，無論是鋅指核酸酶還是轉錄激活因子樣效應物核酸酶都需要人工合成一個很大的識別蛋白，從實驗效率上來講，大大地限制了這些技術的應用。近2年來，一種稱之為CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9的技術涌現出來，由于其高效、設計簡單、成本低廉，大大的提高了其可用性，使得人們快速編輯基因組成為可能。

CRISPR/Cas9系統原本是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質的免疫系統，通過序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，從而提供免疫性。研究表明，原始的該系統一共包含Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA以及RNaseIII四種成分。作為一種位點特異性的基因編輯系統，其識別的特異性是由crRNA序列決定的，人工合成crRNA序列使得Cas9系統識別并結合到與該crRNA互補的DNA序列上，最終介導Cas9蛋白特異性的切割該雜交區域。除了crRNA保證識別特異性外，一個被稱之為原型間隔序列毗鄰區(proto-spaceradjacentmotif，PAM)的序列對于Cas9系統能夠有效穩定的發揮作用有著重要的意義。該序列其使得雙鏈RNA復合體與靶序列精準的結合，并有效地避免了自身結合現象的發生。為了進一步的簡化操作過程，研究人員發現將crRNA和tracrRNA合并到在一起，同樣也能被Cas9蛋白識別，并發揮相應的剪切作用，并將其命名為sgRNA(singleguideRNA)。

最新研究結果顯示，Cas9作為一種基因組編輯工具已經成功應用于酵母、植物、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠和人的細胞模型之中。雖然該系統操作簡單、但是其仍然有自身的不足。一是由于sgRNA對靶序列識別的長度只有20個堿基，且Cas9蛋白對sgRNA5′端序列與靶位點的錯配不敏感，這使得Cas9-sgRNA技術的脫靶率比較高。目前人們已經可以利用成對的突變Cas9突變核酸酶(Cas9D10A)，以及Cas9-FokI融合蛋白等造成雙位點識別切割，有效的提高了Cas9-gRNA技術的特異性。二是Cas9系統的識別位點需要滿足(N₂₀NGG)的條件，它不像TALEN可以全基因組選擇，這就一定程度上限制了位點的選擇，理論上基因組上每8個堿基才會出現這樣一個位點。再加上sgRNA需要promoter啟動，如目前最廣泛應用的U6啟動子。該啟動子還需要第一位為G堿基，以確保轉錄的有效性，使得位點選擇變為(GN₁₉NGG)。如果換成體外轉錄合成sgRNA，則需要用到T7或者SP6啟動子，同樣這些啟動子也需要受到起始堿基為G的限制，使得基因組上選擇位點的可能性變成了每32個堿基才會出現一個位點。從單純的造成基因突變獲得突變體來看，雖然有這些限制存在，但是我們依然可以很好的找到位點來達到我們的目的，但是基因編輯系統更為重要的意義在于它可以精確的修飾基因組任意位置。研究表明，雙鏈DNA斷裂(Doublestrandbreak，DSB)離修飾位點越近，其相應的成功率就越高，這就使得突破位點選擇的一些限制顯得意義極其重大。