[發明專利]5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法

在審

• 申請號: 201510421000.3
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105039309A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 秦偉;林碩;李松
• 申請（專利權）人: 深圳市盛捷生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 生啟

1.一種5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

提供Csy4蛋白；

將所述Csy4蛋白特異性識別的識別序列插入到gRNA對應的DNA序列的N20位點之前得到第一序列，在啟動子后插入用于提高轉錄效率的增益序列得到第二序列，通過搭橋PCR的方法將所述第一序列與所述第二序列連接得到pre-gRNA轉錄模板，接著利用轉錄試劑盒進行體外轉錄得到pre-gRNA；以及

將所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA加入到反應液中，充分反應后提純，提純得到的gRNA即為所需的gRNA。

2.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述提供Csy4蛋白的步驟包括：

將Csy4蛋白的表達序列全長克隆到表達載體中得到表達質粒，將所述表達質粒轉化到大腸桿菌中；

將轉化有表達載體的所述大腸桿菌接入LB培養基擴增，擴增完成后誘導表達12h～16h；

將誘導后的大腸桿菌菌液在冰上加入裂解液進行裂解，裂解完成后離心取上清；以及

對所述上清進行純化后得到所述Csy4蛋白。

3.根據權利要求2所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述裂解液包括50mM的NaH₂PO₄、300mM的NaCl、10mM的咪唑、0.2mg/mL的溶菌酶以及1mM的三(2-羧乙基)膦。

4.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述識別序列為SEQIDNo.1所示的序列。

5.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述增益序列為SEQIDNo.2所示的序列。

6.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述gRNA對應的DNA序列為針對絡氨酸激酶、綠色熒光蛋白、尿卟啉原脫羧酶或E3泛素化連接酶的DNA序列。

7.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述啟動子為T7啟動子或SP6啟動子。

8.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述將所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA加入到反應液中的操作中，所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA的摩爾比為10：1。

9.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述反應液包括20mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和100mM的KCl。

10.根據權利要求1所述的5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法，其特征在于，所述充分反應后提純的操作為：25℃反應20min～30min后采用RNA純化試劑盒提純。