[發(fā)明專利]一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r檢測多核酸目標(biāo)物的方法

在審

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• 申請日: 2015-07-17
• 公開（公告）號: CN104975098A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李賢禎;周國輝;程奇
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江泰晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 大慶市建華專利事務(wù)所 23119
• 代理人: 孫薇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r檢測多核酸目標(biāo)物的方法，是一種在常溫等溫條件下，對多個核酸目標(biāo)物同時進(jìn)行快速、實時、特異性檢測的方法，可在體外臨床檢測、食品安全、生物安全以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)是一類分子生物學(xué)技術(shù)的總稱，它們能在某一特定溫度下保持恒定，實現(xiàn)特定DNA或RNA片段拷貝數(shù)快速增加的過程。在核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域里，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的核酸非等溫擴(kuò)增技術(shù)，在過去的20年里，已在疾病的臨床診斷方面，以其快速、靈敏和特異的優(yōu)勢，日益取代了傳統(tǒng)的診斷方法，并也使一些之前無法完成的診斷成為可能。以微生物病原體的診斷為例，傳統(tǒng)的金標(biāo)法培養(yǎng)法與后續(xù)發(fā)展的免疫檢測法，都存在檢測時間過長、操作繁瑣、以及靈敏性與特異性一般等缺點。但是PCR擴(kuò)增可將原本需要幾天，甚至半個月才獲得結(jié)果的檢測流程簡化至1-2天，給臨床診斷檢測領(lǐng)域帶來了質(zhì)的飛越。

由于PCR是以物理反復(fù)式變溫方式不斷產(chǎn)生線性DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增與復(fù)制，因此，其注定需依賴溫度循環(huán)儀(thermocycler)實現(xiàn)檢測。相比而言，核酸擴(kuò)增技術(shù)的新分支，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)則具有更大的優(yōu)勢。因為此類擴(kuò)增反應(yīng)的全過程均在同一溫度條件下進(jìn)行，使對儀器的精密程度要求大大簡化，反應(yīng)時間也相應(yīng)明顯縮短。例如可通過金屬浴、水浴鍋、甚至是孵育箱或室溫即可完成反應(yīng)，因而它們更能滿足現(xiàn)場、臨床、突發(fā)性或應(yīng)急性檢測的需求，進(jìn)而具有更大、更廣泛的應(yīng)用價值。

正是基于核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的廣闊應(yīng)用前景，世界各國都在此領(lǐng)域進(jìn)行積極與廣泛的研究。目前技術(shù)成熟且研究較多的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)主要包括以下幾種：環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop?mediated?isothermal?amplification,LAMP)，依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)，單引物等溫擴(kuò)增技術(shù)(SPIA)，依賴于解旋酶的等溫擴(kuò)增技術(shù)(HDA)，鏈替換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)，自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR)與切刻內(nèi)切酶核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)(NEMA)。但由于工作原理或引物設(shè)計原理的不同，其中僅有NASBA曾在同一反應(yīng)管中實現(xiàn)過同時檢測兩種RNA的表達(dá)水平。此外，SDA法則是通過與微芯片技術(shù)相結(jié)合后，才實現(xiàn)了多重擴(kuò)增。因此在同一檢測管中，類似熒光定量PCR，通過熒光探針法在常溫等溫的條件下實現(xiàn)核酸的多重檢測的案例，目前尚未見報道。

當(dāng)前，熒光定量PCR或其多重反應(yīng)，因具備實時檢測、同時檢出多項指標(biāo)、高靈敏度和準(zhǔn)確性等優(yōu)點，成為體外分子診斷的主要技術(shù)之一，被廣泛的應(yīng)用到許多領(lǐng)域，例如臨床疾病診斷、病原菌的檢出、出入境動植物的檢驗檢疫等。但是它對精密設(shè)備，即熒光定量PCR儀，的高度依賴性，使其主要集中在中心實驗室內(nèi)使用，未能幫助實驗人員真正在現(xiàn)場實現(xiàn)核酸的快速檢測。此外，由于熒光定量PCR儀的高精密性，使得整個實驗設(shè)置過程相對復(fù)雜，因此不但實驗操作，而且結(jié)果的解讀也都需要受過專業(yè)訓(xùn)練的技術(shù)人員才能完成。這些缺點更讓熒光定量PCR難以在基層檢測實驗室或單位推廣，因而資源匱乏的邊遠(yuǎn)地區(qū)則更不便于使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對以上問題提供一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r檢測多核酸目標(biāo)物的方法，克服目前熒光PCR對精密儀器的依賴較大，且核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的PCR產(chǎn)物定量不夠精確、目前尚不能實現(xiàn)同時檢測多個目標(biāo)物的問題。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r檢測多核酸目標(biāo)物的方法，該方法包括以下步驟：

(1)單鏈結(jié)合蛋白將多個模板雙鏈的母鏈局部打開成單鏈；

(2)重組酶與多對引物結(jié)合成復(fù)合體，在輔助蛋白的作用下結(jié)合到母鏈上，多個熒光探針也與互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，所述的多個熒光探針中部標(biāo)記有四氫呋喃，四氫呋喃兩側(cè)分別為熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間間距為2-6nt，熒光探針3’末端標(biāo)記阻抑聚合酶延伸或擴(kuò)增的修飾基團(tuán)；

(3)DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’末端，進(jìn)行子鏈的延生；

(4)核酸外切酶識別雙鏈狀態(tài)下的多個熒光探針上的四氫呋喃位點，酶切后使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)得以分離，釋放熒光；

(5)多個熒光探針被切斷后，露出了原本被探針3'末端修飾所封閉掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以繼續(xù)延伸形成子鏈；

(6)通過檢測擴(kuò)增曲線的形狀，和熒光信號的強(qiáng)弱，可對待測樣本進(jìn)行定性且半定量檢測。