[發明專利]一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法

在審

• 申請號: 201510420456.8
• 申請日: 2015-07-17
• 公開（公告）號: CN104975098A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 李賢禎;周國輝;程奇
• 申請（專利權）人: 浙江泰晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

1.一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

(1)單鏈結合蛋白將多個模板雙鏈的母鏈局部打開成單鏈；

(2)重組酶與多對引物結合成復合體，在輔助蛋白的作用下結合到母鏈上，多個熒光探針也與互補區域結合，所述的多個熒光探針中部標記有四氫呋喃，四氫呋喃兩側分別為熒光基團和淬滅基團，熒光基團和淬滅基團之間間距為2-6nt，熒光探針3’末端標記阻抑聚合酶延伸或擴增的修飾基團；

(3)DNA聚合酶結合到引物的3’末端，進行子鏈的延生；

(4)核酸外切酶識別雙鏈狀態下的多個熒光探針上的四氫呋喃位點，酶切后使熒光基團和淬滅基團得以分離，釋放熒光；

(5)多個熒光探針被切斷后，露出了原本被探針3'末端修飾所封閉掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以繼續延伸形成子鏈；

(6)通過檢測擴增曲線的形狀，和熒光信號的強弱，可對待測樣本進行定性且半定量檢測。

2.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的熒光探針長度為46-52nt。

3.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的熒光探針3’末端標記阻抑聚合酶延伸或擴增的修飾基團為C3-spacer、磷酸基團、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一種。

4.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的熒光基團為FAM、HEX、VIC、JOE、Texas?Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一種。

5.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的淬滅基團為BHQ1或BHQ2。

6.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的重組酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，輔助蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，單鏈結合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示。

7.根據權利要求1所述的常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法，其特征在于：所述的恒溫條件為25-42度。