[發明專利]一種桐花魚的分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201510419015.6
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105063182B
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 劉廣緒;葉章穎;趙信國;彭超;羅麗健;邢偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

本發明涉及分子生物檢測領域，公開了一種桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：魚體DNA的提取、PCR擴增、酶切及電泳檢測鑒定，通過上述四個步驟即可準確的鑒定測試魚是否為桐花魚。本發明操作簡單，成本低廉，省時準確，對儀器設備要求低。且本方法取魚鱗進行分子鑒定，最大程度上降低了對魚體尤其是活體親魚的損傷，便于推廣應用，能滿足桐花魚養殖業主、政府監管部門對桐花魚親魚、上市桐花魚產品的鑒定需求。

技術領域

本發明涉及分子生物檢測領域，涉及一種桐花魚的分子鑒定方法。

背景技術

桐花魚是我國安徽省的名貴特產，為皖南山區“魚肴四絕”之一，桐花魚口感細嫩、營養豐富，除了富含蛋白質外，還含有大量鈣、磷、鐵等微量元素，受到廣大消費者的喜愛。隨著人民生活水平的提高，近年來桐花魚的市場需求量激增，價格持續走高，也激發了桐花魚養殖業的快速發展。

桐花魚屬于鯉形目鯉科，是典型的溪水魚類，個體較小，全體長一般不超過20厘米，除雄魚在繁殖季節短時間內具有典型的性狀特征外，僅靠外形特征很難將桐花魚與其他常見的鯉科淡水魚分開，例如很難與同等體型大小的鯉魚、青魚、草魚、鰱魚、鳙魚分開。

桐花魚的鑒定存在下面兩個難點：一方面，由于目前桐花魚養殖實踐中的親魚，多來自對捕獲桐花魚的收購。因此養殖業主亟需一種能快速準確、并且盡最大可能不傷害親魚的鑒定方法，用以區分桐花魚的真偽，以規避產業鏈中的后繼損失。另一方面，在水產品市場上也存在一些不法商家用體型較小的其他魚種冒充桐花魚出售的問題，嚴重損害了消費者的正當權益。

到目前為止，尚未見任何桐花魚鑒定技術的報道，這嚴重制約了桐花魚養殖產業的發展和相關管理監督部門工作的開展。因此，急需一種桐花魚快速、準確的鑒定方法，為桐花魚養殖產業健康可持續發展與相關部門監管提供技術支撐。

發明內容

本發明針對目前缺乏桐花魚鑒定技術存在的問題，提供了一種操作簡單、成本低廉、省時準確、最大程度上不損傷魚體的桐花魚的分子鑒定方法。

為了達到上述目的，本發明采取的技術方案如下：

桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：

A.魚磷DNA的提取：在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗4-6片，置于1.5毫升滅菌離心管中，加入30-50微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95攝氏度靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增；

B.PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括1-3微升含100納克DNA的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR產物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用無菌水補足至20微升，置于37攝氏度3～5小時；XbaI(限制性內切酶)為識別TCTAGA堿基序列的XbaI內切酶。

D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產物與1微升6×loading buffer混合，在2％的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統拍照分析電泳結果，根據電泳條帶判定該魚是否桐花魚。

作為優選，步驟A中，步驟A中，裂解液包含10毫摩爾pH為8.2的Tris-HCl，50毫摩爾KCL，體積百分比是0.3％的吐溫20，體積百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和體積百分比是1％的蛋白酶K。

作為優選，步驟A中，用尖頭鑷子在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗。

作為優選，步驟A中，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度恒溫水浴槽中靜置2小時，移至95攝氏度恒溫水浴槽靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增。