[發明專利]一種桐花魚的分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201510419015.6
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105063182B
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 劉廣緒;葉章穎;趙信國;彭超;羅麗健;邢偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

1.桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.魚鱗 DNA的提取：在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗4-6片，置于1.5毫升滅菌離心管中，加入30-50微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95攝氏度靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增；

B.PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括1-3微升含100納克DNA的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR產物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用無菌水補足至20微升，置于37攝氏度3～5小時；

D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產物與1微升6×loading buffer混合，在2％的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統拍照分析電泳結果，根據電泳條帶判定該魚是否桐花魚；

步驟B中，正向引物序列為5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’，反向引物序列為5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，擴增產物為478bp。

2.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟A中，裂解液包含10毫摩爾pH為8.2的Tris-HCl，50毫摩爾KCL，體積百分比是0.3％的吐溫20，體積百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和體積百分比是1％的蛋白酶K。

3.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟A中，用尖頭鑷子在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗。

4.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟A中，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度恒溫水浴槽中靜置2小時，移至95攝氏度恒溫水浴槽靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增。

5.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟B中，PCR反應程序為95℃變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃變性30秒，72℃變性45秒，30個循環；72℃延伸10分鐘，擴展完成。

6.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟C中，置于37攝氏度恒溫水浴槽3～5小時。

7.根據權利要求1所述的桐花魚的分子鑒定方法，其特征在于：步驟D中，若電泳結果出現大小分別為169bp和308bp的兩條電泳條帶，則判定該DNA樣品來自桐花魚。