[發明專利]一種檢測原代神經干細胞遷移極化的方法及其應用

有效

• 申請號: 201510418616.5
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105067810B
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 張敏;賴思強;鄭加麟;許東升;仇麗莎;宋璦宏
• 申請（專利權）人: 上海市第十人民醫院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙)31262
• 代理人: 金重慶

技術領域

本發明涉及神經科學技術領域，具體地說，是一種檢測原代神經干細胞遷移極化的方法及其應用。

背景技術

神經干細胞(Neural stem cell，NSCs)是一種未分化、多潛能、具有自我更新能力的神經前體細胞，可進一步分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。此外，NSCs經過多次細胞分裂后，仍能穩定地保持自身的特性。Sally Temple于1989年首次發現，在小鼠室管膜下區(subventricular zone,SVZ)存在自我更新能力和多向潛能的細胞。1992年，Reynolds B.A.首次從成年小鼠的中樞神經系統中分離出NSCs，并引起人們的廣泛關注。NSCs存在于動物腦內的很多部位，包括哺乳動物胚胎期的大腦皮質、海馬、嗅球、紋狀體等處，另外，在成年哺乳動物中樞神經系統(Central nervous system,CNS)海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒下層中也分離出NSCs。

細胞遷移，是細胞在接收到遷移信號后，通過一系列黏附與去黏附過程，在基質表面產生的整體位移，是一種重要的細胞運動現象。根據遷移的方式可分為無規律的自由遷移(free/random migration)和定向遷移(directional migration)。近年的研究表明，不僅在哺乳動物的胚胎發育過程中，而且在神經系統疾病狀態下NSCs都存在有序的定向遷移能力。在胚胎期中，神經上皮細胞不斷向大腦皮層遷移，進一步分化為神經元，并形成大腦的基本神經構成。新生動物的海馬和側腦室中的NSCs不斷遷移并分化新的神經元，維持海馬和嗅球的神經功能；成年動物的NSCs處于相對靜息的狀態，僅在中樞神經系統損傷、缺血等病理因素的作用下才被激活和遷移到受損部位發揮其功能。NSCs的定向遷移不僅對機體神經系統的發生發育具有至關重要的作用，對于中樞神經系統的損傷修復也有重大的意義。有研究表明，中樞神經系統發生病理改變后，NSCs會特異性地遷移到損傷部位并可分化并替代缺失的細胞，與其它的神經元建立通路，從而使受損腦組織達到解剖和功能上的修復，這無疑為中樞神經疾病的治療帶來了希望的曙光。目前與NSCs遷移的相關因素很多：包括細胞周圍環境、細胞間通訊、細胞代謝產物、NSCs自身及鄰近或遠隔部位其它細胞所分泌的細胞因子、黏附因子、激素和遞質等，但定向遷移的具體機制還不完全清楚，因此了解NSCs定向遷移的機制對于利用NSCs治療神經系統疾病是必須的。

細胞遷移的機制主要涉及到細胞骨架和其結合蛋白以及細胞外基質蛋白的變化，在遷移信號分子的濃度梯度和胞外基質的密度梯度等外界信號的刺激下，細胞內的信號傳遞分子和細胞骨架調節分子產生不對稱的分布和/或激活，導致細胞骨架的形態、分布和細胞器的定位在即將發生遷移的方向上表現出前后不對稱型，這一過程被稱作遷移細胞的極性化(polarization)，細胞由此分化出運動的前段和后部，之后在前段形成遷移所需的特殊結構-偽足，粘著斑(focal adhesion，FA)。在極化過程中涉及多個信號通路和它們下游效應因子的作用，而不同信號通路的作用又必須緊密配合，形成精密的調控網絡，保證極化及遷移的每個步驟能正確完成并密切銜接，而Rho家族小GTP酶(small GTPase)在細胞遷移的協調過程中扮演了關鍵性的角色，尤其Rac1蛋白在細胞遷移過程中發揮了重要作用。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種檢測原代神經干細胞遷移極化的方法。

本發明的再一的目的是，提供上述方法的用途。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種檢測原代神經干細胞遷移極化的方法，包括如下步驟：

a.在模具上用二甲基硅氧烷制備下表面有平行顯微通道的PDMS印章；

b.條帶包被，取消毒的玻片放入培養皿中，加入多聚賴氨酸進行包被，將制備好的PDMS印章扣在多聚賴氨酸包被的玻片上，將需要研究的導向因子用FITC-BSA稀釋到作用濃度，然后加入到印章的微通道一端，于通道另一端抽吸使溶液充滿整個通道，待溶液干后，移除印章，在玻片上形成含有導向因子的平行條帶；

c.在包被好熒光條帶的玻片上進行神經干細胞培養；

d.使用免疫熒光技術進行染色，觀察條帶間隙中神經干細胞貼壁后偽足的方向，計算神經干細胞前端與后端的偽足面積比值，判斷神經干細胞是否極化。

所述PDMS印章下表面的通道寬為60μm、高為100μm，每個平行的通道之間間隔為90μm。

所述步驟b中多聚賴氨酸濃度為0.1mg/ml。