[發(fā)明專利]一種檢測原代神經(jīng)干細胞遷移極化的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510418616.5
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN105067810B
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張敏;賴思強;鄭加麟;許東升;仇麗莎;宋璦宏
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市第十人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 上海卓陽知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31262
• 代理人: 金重慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及神經(jīng)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種檢測原代神經(jīng)干細胞遷移極化的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，NSCs)是一種未分化、多潛能、具有自我更新能力的神經(jīng)前體細胞，可進一步分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞。此外，NSCs經(jīng)過多次細胞分裂后，仍能穩(wěn)定地保持自身的特性。Sally Temple于1989年首次發(fā)現(xiàn)，在小鼠室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)存在自我更新能力和多向潛能的細胞。1992年，Reynolds B.A.首次從成年小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出NSCs，并引起人們的廣泛關(guān)注。NSCs存在于動物腦內(nèi)的很多部位，包括哺乳動物胚胎期的大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球、紋狀體等處，另外，在成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒下層中也分離出NSCs。

細胞遷移，是細胞在接收到遷移信號后，通過一系列黏附與去黏附過程，在基質(zhì)表面產(chǎn)生的整體位移，是一種重要的細胞運動現(xiàn)象。根據(jù)遷移的方式可分為無規(guī)律的自由遷移(free/random migration)和定向遷移(directional migration)。近年的研究表明，不僅在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中，而且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下NSCs都存在有序的定向遷移能力。在胚胎期中，神經(jīng)上皮細胞不斷向大腦皮層遷移，進一步分化為神經(jīng)元，并形成大腦的基本神經(jīng)構(gòu)成。新生動物的海馬和側(cè)腦室中的NSCs不斷遷移并分化新的神經(jīng)元，維持海馬和嗅球的神經(jīng)功能；成年動物的NSCs處于相對靜息的狀態(tài)，僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、缺血等病理因素的作用下才被激活和遷移到受損部位發(fā)揮其功能。NSCs的定向遷移不僅對機體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育具有至關(guān)重要的作用，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)也有重大的意義。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理改變后，NSCs會特異性地遷移到損傷部位并可分化并替代缺失的細胞，與其它的神經(jīng)元建立通路，從而使受損腦組織達到解剖和功能上的修復(fù)，這無疑為中樞神經(jīng)疾病的治療帶來了希望的曙光。目前與NSCs遷移的相關(guān)因素很多：包括細胞周圍環(huán)境、細胞間通訊、細胞代謝產(chǎn)物、NSCs自身及鄰近或遠隔部位其它細胞所分泌的細胞因子、黏附因子、激素和遞質(zhì)等，但定向遷移的具體機制還不完全清楚，因此了解NSCs定向遷移的機制對于利用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是必須的。

細胞遷移的機制主要涉及到細胞骨架和其結(jié)合蛋白以及細胞外基質(zhì)蛋白的變化，在遷移信號分子的濃度梯度和胞外基質(zhì)的密度梯度等外界信號的刺激下，細胞內(nèi)的信號傳遞分子和細胞骨架調(diào)節(jié)分子產(chǎn)生不對稱的分布和/或激活，導(dǎo)致細胞骨架的形態(tài)、分布和細胞器的定位在即將發(fā)生遷移的方向上表現(xiàn)出前后不對稱型，這一過程被稱作遷移細胞的極性化(polarization)，細胞由此分化出運動的前段和后部，之后在前段形成遷移所需的特殊結(jié)構(gòu)-偽足，粘著斑(focal adhesion，F(xiàn)A)。在極化過程中涉及多個信號通路和它們下游效應(yīng)因子的作用，而不同信號通路的作用又必須緊密配合，形成精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，保證極化及遷移的每個步驟能正確完成并密切銜接，而Rho家族小GTP酶(small GTPase)在細胞遷移的協(xié)調(diào)過程中扮演了關(guān)鍵性的角色，尤其Rac1蛋白在細胞遷移過程中發(fā)揮了重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測原代神經(jīng)干細胞遷移極化的方法。

本發(fā)明的再一的目的是，提供上述方法的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種檢測原代神經(jīng)干細胞遷移極化的方法，包括如下步驟：

a.在模具上用二甲基硅氧烷制備下表面有平行顯微通道的PDMS印章；

b.條帶包被，取消毒的玻片放入培養(yǎng)皿中，加入多聚賴氨酸進行包被，將制備好的PDMS印章扣在多聚賴氨酸包被的玻片上，將需要研究的導(dǎo)向因子用FITC-BSA稀釋到作用濃度，然后加入到印章的微通道一端，于通道另一端抽吸使溶液充滿整個通道，待溶液干后，移除印章，在玻片上形成含有導(dǎo)向因子的平行條帶；

c.在包被好熒光條帶的玻片上進行神經(jīng)干細胞培養(yǎng)；

d.使用免疫熒光技術(shù)進行染色，觀察條帶間隙中神經(jīng)干細胞貼壁后偽足的方向，計算神經(jīng)干細胞前端與后端的偽足面積比值，判斷神經(jīng)干細胞是否極化。

所述PDMS印章下表面的通道寬為60μm、高為100μm，每個平行的通道之間間隔為90μm。

所述步驟b中多聚賴氨酸濃度為0.1mg/ml。