[發明專利]一種無損傷提取脈紅螺基因組DNA的方法

在審

• 申請號: 201510414754.6
• 申請日: 2015-07-15
• 公開（公告）號: CN104975001A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 于紅;楊智鵬;李琪;于瑞海;李浩浩
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

技術領域

本發明屬于貝類育種技術領域，具體涉及一種脈紅螺基因組DNA的提取方法。

背景技術

脈紅螺（Rapana?venosa），俗稱海螺、紅螺，成體殼高約11?cm，為大型海洋底棲貝類，廣泛分布于我國渤海、黃海、東海和朝鮮、日本沿海。脈紅螺足部肥大、肉味鮮美，是我國重要的經濟貝類，深受廣大消費者喜愛。近年來，隨著我國脈紅螺種質資源的衰退和市場需求的不斷擴大，脈紅螺已成為我國重要的養殖開發品種，相關的苗種繁育等工作已經開始實施，分子生物學技術也已廣泛地應用于脈紅螺種質資源遺傳多樣性分析、系譜分析、分子標記輔助育種等研究中。基因組DNA提取是開展分子生物學相關研究獲取實驗材料的主要方法。目前已開展的脈紅螺遺傳多樣性分析、家系親權鑒定等研究采用的基因組DNA提取方法均為傷害性取樣，該方法通過殺死脈紅螺而獲得新鮮的組織樣品提取基因組DNA。這種傷害性取樣方法既增加了研究成本，也不利于脈紅螺種質資源的保護。

發明內容

為了克服傷害性取樣方法存在的不足，本發明的目的是提供一種脈紅螺無損傷提取高質量基因組DNA的方法，有助于降低成本、保護脈紅螺種質資源，對開展脈紅螺遺傳學、分子標記輔助育種等研究具有重要的應用價值。

為達到上述目的，本發明采取的具體技術方案如下：

一種脈紅螺無損傷提取基因組DNA的方法，包括如下步驟：

a.?首先用浸有75%酒精的棉球擦拭脈紅螺的殼口和腹足，對其進行消毒；

b.?將脈紅螺放入鹽度為50ppt的海水中5-8分鐘；

c.?將脈紅螺從50ppt的海水中取出，然后放入鹽度為29-31ppt的海水中15-20分鐘，待脈紅螺腹足伸出時將其從海水中取出，用物理刺激的方法使脈紅螺產生粘液；

d.?收集脈紅螺產生的粘液；

e.?在收集到的脈紅螺粘液加入抽提緩沖液400μL，蛋白酶K10μL，混勻之后，于37℃消化10-12?h，最后采用常規的苯酚氯仿法提取脈紅螺基因組DNA。

所述的物理刺激的方法為：掰住脈紅螺的厴，用已消毒的小木棒、塑料或金屬棒輕輕碰觸脈紅螺的腹足，以刺激脈紅螺分泌粘液。

所述收集脈紅螺粘液的方法為：用1.5?mL離心管沿殼口收集300-500μL粘液。

所述抽提緩沖液的配方為：6?mol/L?尿素，10?mmol/L?Tris-HCl，125?mmol/L?NaCl，1%?SDS，10?mmol/L?Na₂EDTA·2H₂O，pH為?7.5。

本發明通過鹽度和物理刺激的方法使脈紅螺產生粘液，刺激后脈紅螺并不會出現死亡現象，保護了取樣個體的組織完整性，沒有造成任何機械性損傷，通過較短時間的恢復期，脈紅螺個體即可從應激狀態中恢復過來，可以長期多次取樣，真正實現了無損傷性基因組DNA提取，是一種科學有效的基因組DNA提取方法；通過75%的酒精消毒，起到了消毒殺菌和減少外源基因組DNA干擾的作用，有利于獲得高質量的基因組DNA。該方法具有對脈紅螺個體無損傷、低成本、操作簡單、基因組DNA提取質量高等優點，可應用于脈紅螺種質資源保護、家系親權鑒定分析、分子輔助育種等。

附圖說明

圖1是本發明實施例1和對比例1提取的脈紅螺基因組DNA的凝膠電泳圖。

圖2是本發明實施例1和對比例1提取的脈紅螺基因組DNA的微衛星位點擴增圖譜。

圖3是本發明實施例1和對比例1提取的脈紅螺基因組DNA的COI擴增圖譜。

其中，1-3：對比例1，M：標準marker，4-9：實施例1。

具體實施方式

以下結合附圖并通過具體實施例對本發明作詳細描述。

實施例1：