[發明專利]豇豆疫霉菌PCR檢測引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510414609.8
• 申請日: 2015-07-15
• 公開（公告）號: CN104928397B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 蘭成忠;阮宏椿;姚婂愛;吳瑋
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及豇豆疫霉菌PCR檢測引物及其檢測方法，專用于豇豆疫霉菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于田間豇豆疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。

背景技術

由豇豆疫霉菌（Phytophthora vignae Purss）侵染引起的豇豆疫病是豇豆生產上不容忽視的主要病害之一，該病害俗稱“死藤”，流行性強，年度間病情差異大，常常造成豇豆植株大面積的枯死，并日趨危害嚴重，平均發病率為3-11%，嚴重田塊發病率高達65%，甚至告成絕收，極大地影響了豇豆的產量和質量。豇豆疫霉菌主要以厚垣孢子、卵孢子及病殘體在土壤中越冬，在適宜的環境條件下，越冬體產生游動孢子，借土壤、灌溉水和風雨等傳播到寄主表面，產生芽管侵入，繼而在其受害部位再產生孢子囊進行再侵染，尤其在潮濕、多雨條件下，該病害傳播與蔓延迅速，常造成豇豆植株大面積死亡。豇豆疫霉菌侵染部位主要為植株根部和近土表莖部，侵染點帶有一定的隱蔽性，在發病前期如果未能準確地對病原菌進行檢測和鑒定，一旦病害顯癥發生就很難控制。豇豆疫病還常與豇豆其它病害（如枯萎病、蔓枯?。┗旌习l生，而且發病癥狀具一定的相似性，常給病害的正確診斷造成極大的困難，在生產中常因病害診斷不準確，未能達到實施“對癥下藥”的正確防治措施而致使病害造成慘重損失的現象時有發生。因此建立豇豆疫霉菌快速檢測體系，在發病前期對植株及土壤是否攜帶豇豆疫霉菌進行快速準確的檢測，這對于病害的準確預測預報、制定適時有效的防治措施、控制病害的傳播和流行（蔓延）以及減少病害造成的經濟損失都具有重要的理論和實際意義。

豇豆疫霉菌傳統的檢測鑒定主要依據形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，這種傳統檢測鑒定方法不僅程序繁瑣、所需時間較長、鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，難以滿足病害防治中快速、準確和穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期。

隨著分子生物學技術的發展，以聚合酶鏈式反應（PCR）技術為代表的病原菌快速分子檢測方法得到了迅猛的發展和應用，PCR技術具有特異性強、靈敏度高、快速且不需要進行病原菌分離培養的特點，可用于病害顯癥之前的早期診斷、監測。國內外已有研究人員利用核糖體轉錄間隔區（rDNA – ITS）基因為病原菌檢測靶標，開發出了灰霉菌、炭疽菌、枯萎病菌、鏈格孢等不同病原真菌的特異性檢測引物，并利用特異性引物進行PCR擴增，達到病原菌快速、準確的檢測和鑒定。豇豆疫霉菌屬于疫霉屬卵菌，大量研究表明，rDNA – ITS基因序列在疫霉菌不同種間差異很小，以ITS為靶標設計的引物難以將疫霉屬中不同種區分開，因此，目前大部分疫霉菌高靈敏性和特異性檢測的主要靶標為Ypt1（ras-related protein）基因。

Ypt1基因包含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內含子在疫霉菌不同種之間具有多變性，該基因可適合作為疫霉菌分子檢測靶標。目前尚無針對該靶基因設計的特異性豇豆疫霉菌檢測引物和檢測方法的報道，因此，可以通過測定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，對疫霉菌不同種間Ypt1基因序列進行比對分析，設計出豇豆疫霉菌特異性引物，達到豇豆疫霉菌的快速檢測和鑒定。

發明內容

本發明的目的是針對現在技術中對豇豆疫霉菌檢測和鑒定主要基于形態學特征，方法耗時長、程序繁瑣、經驗性強、準確度低，難以做到對病害發生的及時監測和鑒定的問題，提供了一種豇豆疫霉菌PCR檢測引物及其檢測方法，利用本發明所述的PCR檢測引物和檢測方法檢測豇豆疫霉菌準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、快速且結果可靠。

實現本發明的目的包括下列步驟（技術方案）：

1. 通過測定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，對疫霉菌不同種間Ypt1基因序列進行比對分析，設計出對豇豆疫霉菌具有特異性擴增作用的1對引物，即特異PCR檢測引物的序列為：

上游引物PVF：5^，- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC-3^，，

下游引物PVR：5^，- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA-3^，；

對豇豆疫霉菌特異性擴增出375bp的產物。

2.豇豆疫霉菌特異分子檢測方法的建立

（1）被豇豆疫霉菌侵染（感染）的植物組織DNA的提取.