[發明專利]豇豆疫霉菌PCR檢測引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510414609.8
• 申請日: 2015-07-15
• 公開（公告）號: CN104928397B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 蘭成忠;阮宏椿;姚婂愛;吳瑋
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

1.豇豆疫霉菌PCR檢測引物，其特征在于引物序列為：

上游引物PVF：5'- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC -3'，

下游引物PVR：5'- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA -3'；

對豇豆疫霉菌特異性擴增出375bp的產物。

2.利用權利要求1所述引物的豇豆疫霉菌檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）從被豇豆疫霉菌感染的植物組織中提取DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用PVF/PVR這一對引物進行PCR擴增，PCR擴增的條件為：PCR反應體系25 μL，包括2.5μL 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶，引物PVF/PVR各0.4 μmol/L，25 ng DNA 模板，不足部分用無菌超純水補足；擴增參數為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min；

（3）取5.0 μL步驟（2）的PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電壓為70-100V，40 min后經溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出375bp的產物，即可判斷所述的檢測樣品中存在豇豆疫霉菌。

3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于：所述從被豇豆疫霉菌感染的植物組織中提取DNA，其具體步驟如下：向1.0 mg洗凈的發病豇豆根或莖中加入0.5 mol/L NaOH 10 μL，將組織充分磨碎成糊后轉入1.5 mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入0.1 mol/L、pH8.0 Tris-HCl 495μL混合均勻，取1.0 μL作為PCR擴增模板。

4.如權利要求1所述的引物在田間豇豆疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定上的應用。