[發明專利]一種檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201510414190.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105154585B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 葛以躍;崔侖標;趙康辰;祁賢;史智揚;周明浩;胡林;尤其敏
• 申請（專利權）人: 江蘇省疾病預防控制中心;杭州優思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 何朝旭;朱磊

本發明涉及一種試劑盒及其應用，尤其是一種檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒及應用，屬于生物技術領域。本發明進一步提供含有寡核苷酸的檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒，包括以下組分：(1)RNA提取試劑；(2)恒溫擴增反應液，包括1×Bst Buffer、甜菜堿、MgSO4、dNTPs、RNase抑制劑、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、滅菌去離子水、所述上下游鏈置換引物、上下游探針和一條交叉擴增引物；(3)陽性對照模板，為發熱伴血小板減少綜合征病毒M基因片段的體外轉錄產物；(4)陰性對照，滅菌去離子水。本發明具有檢測靈敏度高、特異性強、操作步驟簡單、可重復性高、反應時間短等特性，且整個反應過程均在同一溫度下進行，僅需一個恒溫儀器即可完成檢測，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種試劑盒及其應用，尤其是一種檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒及應用，屬于生物技術領域。

背景技術

發熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是威脅我國人民健康和公共衛生安全的重要新發傳染病，其臨床表現以發熱伴血小板、白細胞減少和消化道癥狀為主要特征，重癥死亡率高達15～30％。SFTS很容易與血液、消化、呼吸等多系統疾病相混淆，加上臨床醫生對其缺乏認知，給該病的診斷和鑒別診斷帶來困難。發熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTS virus,SFTSV)需要通過實驗室手段進行確診，常用的方法有病毒分離培養、病毒核酸檢測和免疫學檢測等。病毒分離和免疫學檢測或是操作復雜、費時，不能快速得到檢測結果，或是檢測敏感度不夠。當前，基于PCR技術(常規PCR或熒光定量PCR)對病毒核酸進行檢測是對SFTS進行早期快速診斷的重要手段。PCR技術具有檢測敏感性高，操作簡單、快速等優點，然而其前期投入費用較大(對實驗室功能分區以及PCR儀的依賴)，而且易受實驗室污染而導致假陽性，加上SFTS為人獸共患自然疫源性疾病，多發生于山區和丘陵等醫療衛生條件相對較差的地區，所以，亟待建立一種快速、可靠的，適合基層單位和現場應用的SFTSV核酸檢測技術。申請人檢索發現以下相關專利申請：①新型布尼亞病毒環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及試劑盒，申請號：201510018039.0，公開了檢測新型布尼亞病毒的方法和試劑盒，反應體系中添加了外源性染料，通過染料的顏色變化觀察樣品。②一種新布尼亞病毒的恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，申請號：201410795993.6，公開了快速檢測新布尼亞病毒的試劑盒，并不能對核酸的逆轉錄步驟進行監測。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的缺陷，提出一種檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒及應用，適合基層單位和現場應用的，能夠快速、靈敏、準確地檢測出發熱伴血小板減少綜合征病毒核酸。

本發明通過以下技術方案解決技術問題，首先提供一組檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的寡核苷酸，包括上下游鏈置換引物、上下游探針和交叉擴增引物；

所述上下游鏈置換引物分別為

SFTS-M-F3：5′-TGGATGTTGGCCACTCTC-3′；

SFTS-M-B3：5′-TTCTTCTGATTCAGAACA-3′；

所述上下游探針分別為

上游5′端FITC標記探針

SFTS-M-DF5F：5′-FITC-GAGAGCTCATCCAAGGAT-3′；

下游5′端Biotin標記探針

SFTS-M-DF5B：5′-Biotin-AGCACAAGACCAAATGGGT-3′；

所述交叉擴增引物為

SFTS-M-CPR：