[發明專利]一種檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201510414190.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105154585B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 葛以躍;崔侖標;趙康辰;祁賢;史智揚;周明浩;胡林;尤其敏
• 申請（專利權）人: 江蘇省疾病預防控制中心;杭州優思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 何朝旭;朱磊

1.檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的寡核苷酸，包括上下游鏈置換引物、上下游探針和交叉擴增引物；

所述上下游鏈置換引物分別為

SFTS-M-F3：5′-TGGATGTTGGCCACTCTC-3′；

SFTS-M-B3：5′-TTCTTCTGATTCAGAACA-3′；

所述上下游探針分別為

上游5′端FITC標記探針

SFTS-M-DF5F：5′-FITC-GAGAGCTCATCCAAGGAT-3′；

下游5′端Biotin標記探針

SFTS-M-DF5B：5′-Biotin-AGCACAAGACCAAATGGGT-3′；

所述交叉擴增引物為

SFTS-M-CPR：

5′-AGCACAAGACCAAATGGGTTCCCTTCCTTATAGC

ACAC-3′。

2.含有權利要求1所述寡核苷酸的檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒，包括以下組分：

(1)RNA提取試劑；

(2)恒溫擴增反應液，包括1×Bst Buffer、甜菜堿、MgSO4、dNTPs、RNase抑制劑、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、滅菌去離子水、所述上下游鏈置換引物、上下游探針和一條交叉擴增引物；

(3)陽性對照模板，為發熱伴血小板減少綜合征病毒M基因片段的體外轉錄產物；

(4)陰性對照，滅菌去離子水。

3.根據權利要求2所述檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒，其特征在于：所述恒溫擴增反應液含有pH＝8.8 20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4、0.1％TritonX-100％、8U Bst DNA聚合酶、10U AMV逆轉錄酶、1M甜菜堿、10U RNaseInhibitor、dNTPs各0.8mM、上下游鏈置換引物各0.1μM、上下游探針各0.3～0.5μM、交叉擴增引物0.5μM。

4.根據權利要求2所述檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒，其特征在于：所述陽性對照模板按如下步驟制備，以下游鏈置換引物和帶有T7啟動子的上游鏈置換引物對發熱伴血小板減少綜合征病毒的基因組RNA進行RT-PCR擴增；利用PCR產物純化試劑盒對擴增產物進行純化；以T7RNA聚合酶體外轉錄目的RNA片段；以紫外分光光度計測A260對RNA片段進行定量，將陽性對照模板稀釋至105拷貝/μl，分裝后-20℃保存。

5.權利要求2所述檢測發熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫擴增試劑盒非診斷目的的應用，包括以下步驟：

第一步、用RNA提取試劑從待檢標本中提取病毒RNA；

第二步、將步驟一提取得到的病毒RNA作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中；對照PCR管中分別加入陽性對照模板和陰性對照；60℃擴增反應60min；

第三步、將反應后的PCR管置入垂直流動核酸試紙條防污染檢測裝置中進行檢測，5min后判讀實驗結果：當試紙條的質控線和檢測線均呈紅色時，為陽性，說明樣品中含有發熱伴血小板減少綜合征病毒核酸；當試紙條的質控線呈紅色，而檢測線為無色時，為陰性，說明樣品中不含有發熱伴血小板減少綜合征病毒核酸；當試紙條的質控線呈無色時，無論檢測線是否為紅色，均表明實驗失敗，需對樣品進行重復檢測。