[發明專利]一種鉻-IgM螯合物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510413333.1
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN104987415A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 張積仁;陽帆;董欣敏;吳婧;蔡睿;孫遙;趙乙木
• 申請（專利權）人: 上海拜豪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;G01N33/68;G01N33/96
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術領域

本發明涉及檢測領域，更具體地說，涉及一種鉻-IgM螯合物及其制備方法和應用。

背景技術

血清中IgM是由5個單體通過一個J鏈和二硫鍵連接成五聚體，分子量最大，為970kD，沉降系數為19S，稱為巨球蛋白(macroglobulin)。在分子結構上IgM無鉸鏈區，Cμ2可能替代了鉸鏈區的功能。在生物進化過程中IgM是最早出現的免疫球蛋白。在個體發育過程中，無論是B細胞膜表面Ig(SmIg)，還是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出現的Ig，在胚胎發育晚期的胎兒即有能力產生IgM。在抗原刺激誘導體液免疫應答過程中，一般IgM也最先產生。IgM占血清總Ig的5％～10％。由于IgM在免疫應答早期產生，并在補體參與下的溶血作用比IgG強500倍以上，而且活化補體后通過C3b、C4b等片段發揮調理作用，因此IgM在機體的早期免疫防護中占有重要地位。天然的血型抗體(凝集素)為IgM，血型不符的輸血，易發生嚴重的溶血反應。IgM不能過胎盤，臍血中如出現針對某種病原微生物的IgM，表示胚胎期有相應病原微生物如梅毒螺旋體、風疹或巨細胞毒等感染，稱為胚胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有產量單體IgM。

鉻(chromium，Cr)是元素周期表Ⅵ族中的一種過渡金屬，其質地堅硬，表面具有光澤，有較高的熔點，在工業生產中具有重大的經濟價值，一個世紀以來被廣泛應用，每年全球鉻生產量高達107噸，因而鉻是一種名副其實的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應用于電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關,但是同樣也對人類的身體健康產生巨大影響。在美國，Cr與Hg、Cd、Pb被稱為四大環境污染物。據統計，每年有幾十個億的民眾都在飲用鉻污染的水源，而在加利福利亞有高達30％的水資源都已經被鉻污染，因而鉻污染嚴重影響著人們的身體健康。

自然界中鉻主要以三價和六價的形式存在，而一般認為，三價鉻是人類所需的微量元素，而六價鉻才是明顯的毒性物質。由于六價鉻易通過細胞膜進入細胞，而且可以通過一系列反應，產生強烈的細胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價鉻的毒性高于三價鉻，達10—100倍。學者認為當水中的六價鉻含量超過0.05mg/L即是有毒的。六價鉻可以通過皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進入人體，對于職業性暴露人群主要是通過呼吸道吸入六價鉻灰塵，而對于普通人群則是通過飲入污染水源、食入被污染的食物、吸入等方式攝入六價鉻。六價鉻進入體內后，可以引發氧化應激、染色體畸變、細胞凋亡、多種DNA損傷(包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質交聯、DNA-氨基酸交聯、Cr-DNA配合物形成等)，從而造成機體多處組織、器官、系統損傷。不僅如此，六價鉻還被認為是一種強有力的致癌物，早在1990年國際癌癥研究組織(International?Agency?for?Research?on?Cancer，IARC)就將六價鉻作為一種人類致癌物。關于六價鉻的細胞毒性、基因毒性、致癌性已成為當前廣泛研究的課題。

關于鉻中毒，特別是慢性鉻中毒的評價，僅能通過檢測血鉻含量，間接反應人體內的循環鉻含量，無法進一步評估鉻對于機體功能的損傷程度，而隨著科學技術的飛速發展，鉻與人體的關系也日益緊密，因而尋找一種可以從機體功能角度評價鉻中毒，特別是慢性鉻中毒對于機體的損害程度的評價方式日益重要。

發明內容

針對鉻污染嚴重的問題，本發明的目的在于提供一種鉻-IgM螯合物及其制備方法，并建立鉻-IgM螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鉻-IgM螯合物在評價一個地區鉻污染程度的應用。通過定量檢測一個地區人群血清中鉻-IgM螯合物可以間接反映這個地區人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個地區鉻污染程度。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種鉻-IgM螯合物，鉻離子與IgM通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。

本發明還提供一種上述的鉻-IgM螯合物的制備方法，包括以下步驟：

A)鉻與IgM的螯合反應：在人源的IgM中加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶液；

B)純化鉻-IgM螯合物的提取：采用免疫親和層析法，去除反應溶液中未反應的IgM以及多余的鉻離子，即得鉻-IgM螯合物。

其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：

(1)溶解樣品：向經過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水，使鉻-IgM螯合物復溶；

(2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱；