[發明專利]一種鉻-IgM螯合物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510413333.1
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN104987415A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 張積仁;陽帆;董欣敏;吳婧;蔡睿;孫遙;趙乙木
• 申請（專利權）人: 上海拜豪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;G01N33/68;G01N33/96
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種鉻-IgM螯合物，其特征在于，鉻離子與IgM通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。

2.一種如權利要求1所述的鉻-IgM螯合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A)鉻與IgM的螯合反應：在人源的的IgM或按照生物學方法重組的IgM中加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶液；

B)純化鉻-IgM螯合物的提取：采用免疫親和層析法，去除反應溶液中未反應的IgM以及多余的鉻離子，即得鉻-IgM螯合物。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，

所述步驟B)具體如下：

(1)溶解樣品：向經過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水，使鉻-IgM螯合物復溶；

(2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱；

(3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(1)中樣品，然后上柱，IgM與填料特異性結合；

(4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸鹽溶液進行洗脫；

(5)收集：收集經過步驟(4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性；

(6)透析：將步驟(5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本；

(7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鉻特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；

(8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；

(9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸鹽溶液進行洗脫；

(10)收集：收集經過步驟(9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性；

(11)透析：將步驟(10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本，即得鉻-IgM螯合物。

4.根據權利要求2所述的鉻-IgM螯合物的制備方法，其特征在于，還包括步驟C)：對鉻-IgM螯合物的鑒定；

其中，步驟C)中具體如下：

(1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；

(2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-IgM螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；

(3)電泳：連接電泳板，進行電泳；

(4)檢測：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復溶，然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。

5.一種如權利要求1所述的鉻-IgM螯合物在制備檢測血樣中鉻-IgM螯合物的試劑或試劑盒中的應用。

6.一種至少包括如權利要求1所述的鉻-IgM螯合物作為標準品的試劑盒。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgM的蛋白或可捕獲金屬鉻的物質。

8.一種定量檢測鉻-IgM螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權利要求1所述的鉻-IgM螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、酶聯免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純鉻-IgM螯合物與酶聯免疫結合法、提純鉻-IgM螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鉻-IgM螯合物與電感耦合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。