[發明專利]一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM非標記探針方法及其引物和探針

有效

• 申請號: 201510412700.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105154584B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 張建峰;劉志成;嘎利兵嘎;陳琴苓;徐志宏;張春紅;康樺華;郭鵬舉
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種快速區分PRRSV經典和變異毒株HRM非標記探針方法及其引物和探針，操作簡單：只需PCR反應之前加UN?Probe和熒光飽和染料即可；檢測速度快且高通量：全部操作過程只需3小時，極大縮短了分型所需時間；費用低，不需要特異性熒光標記探針，每個樣品的飽和染料成本為1.6 RMB；準確性高、特異性好，重復性好，可以準確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應用。

技術領域

本發明涉及病毒經典毒株與變異毒株的鑒別方法，具體涉及一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM非標記探針方法及其引物和探針。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）感染引起，主要特征為懷孕母豬發生流產、早產和死胎等嚴重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。根據病毒基因組的差異，PRRSV可分為兩個基因型, 即歐洲型和北美洲型。雖然PRRSV流行毒株有美洲型和歐洲型，但迄今為止，在我國流行的PRRSV的基因型均為北美洲型，包括以北美洲型 PRRSV CH-1a株為代表的經典毒株（C-PRRSV）和2006年以后開始流行的以JXA1、HuN4和TJ為代表的變異毒株（H-PRRSV）。

PRRS傳播非常迅速，豬群一旦感染即呈持續性，污染豬場可成為疫源地。尤其以H-PRRSV引起的“高熱”病，仔豬發病率高達100%，死亡率可達50%以上，母豬流產率在30%以上，育肥豬也可發病死亡，損失巨大。由于RRRSV感染豬群易引起繼發感染（細菌性或病毒性繼發），使得臨床癥狀和病理變化復雜化，特別是近年來越來越多的PRRS呈現亞臨床型和慢性型病例，僅根據臨床癥狀和病變及流行病學特點很難做出診斷，因此PRRSV的實驗室診斷至關重要，尤其需要快速鑒別PRRSV經典毒株和高致病性變異株的診斷技術。目前，鑒別C-PRRSV和H-PRRSV方法主要包括One Step RT-PCR方法（Yang K, Li Y, Duan Z, et al. Aone-step RT-PCR assay to detect and discriminate porcine reproductive andrespiratory syndrome viruses in clinical specimens. Gene. 2013, 531（2）:199-204.）；同時檢測PRRSV 歐洲型、北美洲型和H-PRRSV的多重熒光定量PCR方法（Wernike K,Hoffmann B, Dauber M, et al. Detection and typing of highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus by multiplex real-timert-PCR. PloS one. 2012, 7（6）:e38251.）；檢測C-PRRSV和H-PRRSV的SYBR熒光染料法（Chai Z, Ma W, Fu F, et al. A SYBR Green-based real-time RT-PCR assay forsimple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic andclassical type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome viruscirculating in China. Archives of virology. 2013, 158（2）:407-415.）和同時檢測C-PRRSV和H-PRRSV的MGB探針方法（Chen NH, Chen XZ, Hu DM, et al. Rapiddifferential detection of classical and highly pathogenic North AmericanPorcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in China by a duplexreal-time RT-PCR. Journal of virological methods. 2009, 161（2）:192-198.）等等。雖然以上方法均能夠區分PRRSV經典毒株和變異毒株，但傳統的PCR檢測技術如One StepRT-PCR方法需要對RT-PCR產物進行凝膠電泳分析，易造成PCR產物污染，導致假陽性，靈敏度低。而熒光定量PCR 雖然靈敏度高，但價格昂貴，需同時合成2個或以上探針。本研究擬利用HRM非標記探針方法（UP-HRM）對C-PRRSV和H-PRRSV進行鑒別。UP-HRM檢測方法探針無需熒光標記，只需在PCR擴增前加入一定體積的飽和熒光染料，只需1個非標記探針即可對C-PRRSV和H-PRRSV進行鑒別。