[發明專利]一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM非標記探針方法及其引物和探針

有效

• 申請號: 201510412700.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105154584B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 張建峰;劉志成;嘎利兵嘎;陳琴苓;徐志宏;張春紅;康樺華;郭鵬舉
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM非標記探針方法的引物，其核苷酸序列如下所示：

引物P1：GAYATTCATCATTACACCAGT(SEQ ID NO：1)，

引物P2：AACACYCCGCCAGAGCC(SEQ ID NO：2)，

引物P3：GCYACCGCACCAGATGGRACCTACTT(SEQ ID NO：3)，

引物P4：ACGGTGTTCAGTGAGGGC(SEQ ID NO：4)，

所述PRRSV的經典毒株為CH-1R，變異毒株為JXA1-R。

2.一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有權利要求1所述的引物，所述PRRSV的經典毒株為CH-1R，變異毒株為JXA1-R。

3.根據權利要求2中所述的試劑盒，其特征在于：該試劑盒還含有探針，其核苷酸序列如下所示：

探針UN-Probe：GTCCGCCGTGCTGCGCTGACTGG(SEQ ID NO：5)或其核苷酸互補序列。

4.一種快速區分PRRSV經典毒株和變異毒株的HRM非標記探針方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)從樣品中提取病毒核酸；

2)以核酸為模板，用權利要求1所述的引物對P1和P2進行預擴增反應獲得預擴增產物；

3)以預擴增產物作為DNA模板，用權利要求1所述的引物對P3、P4、權利要求3所述的探針UN-Probe及熒光飽和染料進行PCR-HRM擴增反應獲得擴增產物；

4)對擴增產物進行HRM分析，確定病毒類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療，

所述PRRSV的經典毒株為CH-1R，變異毒株為JXA1-R。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟2)中PCR預擴增反應體系為：

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟2)中的預擴增反應程序為：50℃反轉錄30min；95℃預變性2min；95℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循環35次。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟3)中的PCR-HRM擴增反應體系為：

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟3)中的PCR-HRM擴增反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循環55次；98℃變性2min，40℃雜合2min，45℃到98℃以0.3℃/s的熔解速率進行熔解曲線分析。

9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟4)中所述HRM分析的具體分析過程為：

以PRRSV經典毒株CH-1R的標準樣品為陽性對照，待檢樣品和陽性對照之間探針峰ΔTm值的絕對值小于2.0℃時判定為PRRSV經典毒株；

以PRRSV變異毒株JXA1-R的標準樣品為陽性對照，待檢樣品和陽性對照之間探針峰ΔTm值的絕對值小于2.0℃時判定為PRRSV變異毒株。