[發(fā)明專利]能抑制豬流感病毒的shRNA轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510412627.2
• 申請(qǐng)日: 2015-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN105002179B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟慶文;王偉;陳洪巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/79;C12N5/10;A61K48/00;A61P31/16
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發(fā)明提供一種能抑制豬流感病毒的shRNA轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有四個(gè)shRNA表達(dá)基因，能同時(shí)編碼四種分別靶向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守區(qū)域的特異shRNA。該質(zhì)粒適用于多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。使用慢病毒載體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培育的MDCK細(xì)胞后，經(jīng)攻毒實(shí)驗(yàn)證明，篩選得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有抵抗不同亞型流感病毒感染的能力。將該質(zhì)粒通過靜脈與肌肉注射入4周齡仔豬，然后用H3N2亞型豬流感病毒感染，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液注射組具有更強(qiáng)的抑制流感病毒的復(fù)制。為RNAi應(yīng)用于豬流感病毒的研究以及豬流感的防治積累了必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為轉(zhuǎn)基因豬抗流感研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種能抑制豬流感病毒的shRNA轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬流感(Swine Influenza，SI)是由正粘病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)引起的一種急性、高度接觸傳染的呼吸道疾病，臨床癥狀表現(xiàn)為，發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕，結(jié)膜炎、厭食及精神不振等。豬流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)能在豬上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，造成豬感染，致使豬體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)菌、支原體和其他病毒的繼發(fā)或混合感染，使疫情加重，病豬死亡率上升，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失。越來越多的資料表明，豬作為流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨種屬障礙感染新宿主的過程中，起著重要的作用。豬上皮細(xì)胞具有唾液酸α-2,6半乳糖苷和唾液酸α-2,3半乳糖苷，人流感病毒可與前者結(jié)合，而禽流感病毒與后者結(jié)合，由此決定了能夠同時(shí)被人流感病毒和禽流感病毒感染，使其成為IAV發(fā)生基因重組或重排的主要場所。豬流感HA受體結(jié)合位點(diǎn)具有與兩種流感病毒受體相同的結(jié)合特異性，是SIV不僅可感染豬，同時(shí)也具有感染禽和人類的能力。因此，豬流感除了具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義外，還具有深遠(yuǎn)的人類公共衛(wèi)生意義。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，由dsRNA(double-strand RNA)或siRNA(small interfering RNA，siRNA)引發(fā)的對(duì)同源性mRNA降解的現(xiàn)象。它最大優(yōu)點(diǎn)在于具有高度的有效性和特異性，且具有快速的預(yù)防與治療效果。它的作用在基因功能研究和病毒性疾病的治療領(lǐng)域有非常廣闊的前景，例如在抗艾滋病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發(fā)現(xiàn)，RNAi對(duì)于抑制這些病毒的復(fù)制具有較好的效果，可能是這類病毒病治療的有效途徑。

A型流感病毒(IAV)屬于正粘病毒科，是單股負(fù)鏈RNA病毒，以變異速度快、感染致病性強(qiáng)、傳播速度快成為造成人、哺乳動(dòng)物和禽類流感大流行的主要病毒。目前抗病毒藥物和疫苗免疫存在局限性，使病毒對(duì)藥物產(chǎn)生耐受性，迫于選擇壓力病毒會(huì)快速發(fā)生變異以逃避藥物或疫苗免疫；研究人員選擇RNAi方法抑制流感病毒的復(fù)制通常針對(duì)流感病毒基因的保守序列作為靶序列，由于干擾序列的高度轉(zhuǎn)移性，使RNAi技術(shù)在流感病毒防治的應(yīng)用中也遇到了技術(shù)屏障。因此，亟需開發(fā)一種基于RNAi技術(shù)的抗病毒治療新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能抑制豬流感病毒的shRNA轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種能抑制豬流感病毒復(fù)制與感染的shRNA，所述shRNA是以豬流感病毒PB2，以及任選PA、PB1、NP中的至少兩種為靶基因，編碼所述shRNA的核苷酸序列為(如SEQ ID No.1-8所示的核苷酸序列)：

具體的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，shRNA以豬流感病毒PB2、PA、PB1和NP為靶基因；

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，shRNA以豬流感病毒PB2、PA和PB1為靶基因；

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，shRNA以豬流感病毒PB2、PA和NP為靶基因；