[發明專利]基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法

有效

• 申請號: 201510412330.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105004780B
• 公開（公告）日: 2018-01-05
• 發明（設計）人: 繆鵬;王弼陡;陳錫峰;孫海旋;唐玉國
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及microRNA的檢測領域，特別涉及一種基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法。

背景技術

microRNA是一類內源性的具有基因調控功能的非編碼RNA，其大小約為18～25個核苷酸。microRNA能夠參與細胞內多種調控通路，包括發育、細胞增殖和凋亡、器官形成、造血過程、病毒防御、代謝等。越來越多的研究發現，microRNA在腫瘤發生發展過程中起至關重要的作用，已成為一類理想的腫瘤標記物。所以定量檢測microRNA對了解其生物功能，癌癥的早期診斷、新藥的開發及其他涉及生物的科研項目，都具有十分重要的意義。與傳統的核酸檢測相比，microRNA具有的一些獨有的特點，如序列短，家族序列同源性高及低豐度表達，這些特點增加了其檢測的難度。目前檢測microRNA的方法主要有Northern印跡分析，微陣列芯片技術，聚合酶鏈式反應(PCR)等。雖然Northern印跡是當前microRNA分析的標準方法，但操作繁瑣，耗時長，靈敏度低，分析檢測時需要大量的樣品及分離富集步驟，而且對污染非常敏感，實驗中每一步操作不當都會影響分析結果。微陣列芯片技術雖然可實現高通量，多組分同時檢測，但是其制作和檢測費用高；芯片上可利用的樣品體積很小，導致靈敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同時優化所有待測的microRNA雜交環境，所以選擇性不高。聚合酶鏈式反應(PCR)是現在定量檢測microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，莖環引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。雖然基于聚合酶鏈式反應的microRNA檢測方法具有快速、特異性強、靈敏度高等特點，但是需要逆轉錄操作，增加了實驗的成本和設計的復雜性。隨著新的microRNA序列不斷發現和對microRNA功能研究的逐步深入，對microRNA的分析檢測提出了新要求。因此，開發簡單直接，靈敏度高，特異性強，準確檢測microRNA的分析技術仍然是一個挑戰。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，此法具有操作簡單，靈敏度高，特異性強，背景信號低，適用范圍廣等優點。

本發明采用的技術方案如下：

一種用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1)將電極浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反應6小時，隨后將電極浸入含0.1M的巰基己醇的溶液中，在37℃下反應1小時；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一個巰基和一個氨基；

步驟2)將電極浸入含飽和銀納米顆粒的溶液中，在37℃下反應1小時，隨后將電極浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反應0.5小時；其中，所述第二DNA片段分子能夠與所述第一DNA片段分子進行堿基互補配對；

步驟3)分別配制至少四種不同濃度的microRNA標準液；

步驟4)將電極浸入microRNA標準液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5單位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反應1小時；所述第二DNA片段分子能夠與游離態的microRNA發生反應形成雜交體，所述第三DNA片段分子能夠通過鏈置換反應將microRNA從該雜交體中再次解離出來，使microRNA回到游離態，起始新一輪的雜交與鏈置換反應；

步驟5)將電極浸入100μL濃度為0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反應1小時；

步驟6)取出電極，將其作為工作電極，以Ag/AgCl為參比電極、鉑絲電極為對電極、0.1M的氯化鉀溶液為電解液，采用線性掃描伏安法進行檢測，將得到的電信號與microRNA標準液的濃度關系繪制成標準曲線圖；

步驟7)將經步驟1)和2)修飾后的電極浸入待測液中，按步驟4)～6)的方法得到待測液的電信號，通過與標準曲線圖進行比對，得到待測液中microRNA的濃度。

優選的是，所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其中，所述線性掃描伏安法的掃速為100mV/s。

優選的是，所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其中，所述microRNA標準液的濃度不超過10nM。