[發(fā)明專利]基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510412330.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105004780B
• 公開（公告）日: 2018-01-05
• 發(fā)明（設計）人: 繆鵬;王弼陡;陳錫峰;孫海旋;唐玉國
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

1.一種用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1)將電極浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反應6小時，隨后將電極浸入含0.1M的巰基己醇的溶液中，在37℃下反應1小時；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一個巰基和一個氨基；

步驟2)將經步驟1)修飾后的電極浸入含飽和銀納米顆粒的溶液中，在37℃下反應1小時，隨后將電極浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反應0.5小時；其中，所述第二DNA片段分子能夠與所述第一DNA片段分子進行堿基互補配對；

步驟3)分別配制至少四種不同濃度的microRNA標準液；

步驟4)將經步驟1)和2)修飾后的電極浸入microRNA標準液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5單位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反應1小時；所述第二DNA片段分子能夠與游離態(tài)的microRNA發(fā)生反應形成雜交體，所述第三DNA片段分子能夠通過鏈置換反應將microRNA從該雜交體中再次解離出來，使microRNA回到游離態(tài)，起始新一輪的雜交與鏈置換反應；

步驟5)將經步驟4)反應后的電極浸入100μL濃度為0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反應1小時；

步驟6)取出經步驟5)反應后的電極，將其作為工作電極，以Ag/AgCl為參比電極、鉑絲電極為對電極、0.1M的氯化鉀溶液為電解液，采用線性掃描伏安法進行檢測，將得到的電信號與microRNA標準液的濃度關系繪制成標準曲線圖；

步驟7)將經步驟1)和2)修飾后的電極浸入待測液中，按步驟4)～6)的方法得到待測液的電信號，通過與標準曲線圖進行比對，得到待測液中microRNA的濃度。

2.如權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其特征在于，所述線性掃描伏安法的掃速為100mV/s。

3.如權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其特征在于，所述microRNA標準液的濃度不超過10nM。

4.如權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其特征在于，在步驟1)開始前，對電極進行預處理，具體包括：將電極浸泡在水虎魚溶液中5分鐘，所述水虎魚溶液的配方為98％硫酸：30％雙氧水＝3:1；使用5000目砂紙分別與粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm大小的氧化鋁漿對電極進行打磨，隨后將電極放入乙醇中超聲5分鐘，再放入純水中超聲5分鐘，隨后將電極放入50％硝酸中浸泡30分鐘，最后在0.5M硫酸中進行清洗。

5.如權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其特征在于，所述電極為金電極。

6.如權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的基于恒溫反應的針對待測液中microRNA的檢測方法，其特征在于，所述銀納米顆粒通過以下方法制得：配制含0.25mM硝酸銀與0.25mM檸檬酸三鈉的混合溶液，配制10mM的硼氫化鈉溶液，將100mL混合溶液與3mL硼氫化鈉溶液混合，并劇烈攪拌30分鐘；靜置過夜后，通過離心得到銀納米顆粒。