[發明專利]一種牛奶產品中頭孢類藥物殘留的多聯檢測方法

有效

• 申請號: 201510403783.2
• 申請日: 2015-07-01
• 公開（公告）號: CN105116063B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 孫海新;許娜;張慧;孫丕春;黃金發
• 申請（專利權）人: 山東世通檢測評價技術服務有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于動物源性食品中藥物殘留的檢測技術領域，是一種用高效液相色譜儀測定牛奶產品中頭孢類藥物殘留量的方法。

背景技術

隨著我國畜牧業的快速發展，獸藥在降低畜禽發病率和致死率、促進動物生產、改善動物肉制品品質和提高飼料利用率方面起到了顯著的作用，已成為現代畜牧業的重要支撐。頭孢菌素類(Cephalosporins)屬于β-內酰胺類抗生素，具有耐青霉素酶、療效高、毒性低、過敏反應少、抗菌譜廣等特點，可有效抑制細菌的生長和繁殖。在畜牧動物養殖中，頭孢類抗生素廣泛用于奶牛乳房炎的預防與治療，動物尿道、胃腸道及呼吸道等的細菌病的治療和防治。但是在實際養殖過程中，由于使用方法的不規范，不但造成動物源細菌病原的耐藥性上升，引發超劑量用藥的惡性循環，而且導致畜產品中的藥物殘留量的積累，引起食品安全隱患，給人類帶來過敏、腸道菌群失調、耐藥性上升等嚴重危害。因此，中國農業部明確規定(農業部560號公告)：“頭孢哌酮等人醫臨床控制使用的最新抗菌藥物用于食品動物，會產生耐藥性問題，影響動物疫病控制、食品安全和人類健康，予以注銷產品批準文號，不得再生產、經營和使用。”目前對頭孢類獸藥殘留的檢測方法多為針對單個藥物的檢測，不適應對目前多種頭孢類獸藥進行監控，因此，建立一種準確、穩定的多聯檢測方法對于實現該類藥物的有效監控具有重要意義。

中國專利(CN200910085945.7)公開了一種檢測頭孢類藥物的酶聯免疫試劑盒及其應用，通過酶聯免疫法對頭孢類獸藥殘留進行檢測，只能通過吸光值粗略判斷殘留量，抗體制備步驟繁瑣，檢出限高，不易用作精確定量檢測。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種定量檢測牛奶產品中頭孢類抗生素殘留的多聯檢測方法，滿足對畜牧臨床領域禁用的頭孢類抗生素的多聯檢測需求。本發明對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩等4種頭孢類藥物的檢出限為分別為0.26mg/kg、0.01mg/Kg、0.10mg/kg、0.07mg/Kg；在1mg/kg～50mg/kg添加濃度范圍內線性關系良好，回收率為90％～105％；本方法的批內相對標準偏差≤15％，批間相對標準偏差≤20％。

本發明的技術方案是一種檢測牛奶中頭孢類抗生素的多聯檢測方法，包括樣品預提取、標準曲線繪制、儀器檢測分析步驟，所述檢測方法為使用高效液相色譜進行的一種多聯檢測方法，同時檢測的藥物包括頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩，具體包括如下步驟：

(1)樣品預提取：稱取牛奶樣品置于離心管中，加入蛋白清除劑，超聲波處理后離心，吸取上清液至試管中，氮氣吹干，加入與樣品等體積的甲醇-0.1％甲酸溶液復溶，加入脂肪清除劑去除脂肪，振蕩，離心，棄去正己烷后液體經有機濾膜過濾后轉移至棕色瓶中，備用；

優選為稱取牛奶樣品置于離心管中，加入乙腈，超聲波處理，5000rpm離心10min，吸取上清液至試管中，氮氣吹干，加入與樣品等體積甲醇-0.1％甲酸溶液復溶，加入正己烷去除脂肪，振蕩，5000rpm離心10min，棄去正己烷，經有機濾膜過濾后轉移至棕色瓶中，備用；

(2)標準溶液配制及標準曲線的繪制：取標準工作液，用甲醇-0.1％甲酸溶液進行不同倍數稀釋，繪制標準曲線；

優選為分別準確稱取頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩標準品各100mg，用甲醇-0.1％甲酸溶解并定容到4個10mL棕色容量瓶中配制成單標準品溶液，再分別吸取適量單標準品溶液轉移至1個10mL棕色容量瓶中精確定容，配制成濃度為1mg/mL的混合標準品儲備溶液。再用甲醇-0.1％甲酸溶液將混合標準品溶液經適當稀釋，配制成濃度分別為0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.050mg/mL的混合標準品工作液，采用高效液相色譜儀進行分析，繪制標準曲線，計算標準回歸方程；

(3)將步驟(1)所得樣品進高效液相色譜儀器檢測，將檢測結果與所述標準曲線對比得到待測物濃度。

優選條件為采用Agilent1100型高效液相色譜儀；Agilent(C18，4.6x250，5μm)ZORBAXEclipsePlus反相色譜柱；流動相為A-甲醇，B-0.1％甲酸溶液，A∶B(體積比)＝3∶7～4∶6；檢測波長為254nm；流速為1ml/min；柱溫為35℃；進樣量為20μl。

進一步的，所述步驟(1)中的超聲波處理方法為間歇式，超聲波處理5秒，間歇5秒，60個循環。

進一步的，所述步驟(1)中的蛋白清除劑為乙腈，樣品液與乙腈的體積比為1∶3～1∶4。