[發明專利]一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法及應用

在審

• 申請號: 201510401698.2
• 申請日: 2015-07-08
• 公開（公告）號: CN105039396A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 郭海朋;蔣德安;洪春桃;鄭炳松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 黃平英

技術領域

本發明涉及植物轉基因技術領域，具體涉及一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法。

背景技術

荻(Miscanthussacchariflorus(Maxim)Benth.)為禾本科多年生水陸兩生的草本植物。荻高1～1.5m，直徑約5mm，具有10多個節和發達被鱗片的長匍匐根狀莖，原產于東亞，目前在我國東北、華北、西北和華東地區均有分布。因具有再生能力強、適應性強和干物質產量高等特點，被認為是一種重要的能源植物。而利用能源植物開展重金屬污染土壤修復可以實現生物質原料生產與污染土壤治理的雙贏。

例如，公開號為CN101786097A的中國發明專利申請文獻公開了一種修復鎘鉛等重金屬污染土壤的方法，技術方案是：在含污染物鎘鉛等金屬的土壤上種植荻，當荻長到成熟期后，將荻整體從污染土壤上移走；在含污染物鎘鉛等重金屬的土壤上種植荻，采用露天常規栽培，調節土壤水份和營養成分。

公開號為CN104472328A的中國發明專利申請文獻公開了一種富硒荻筍的栽培方法，屬于食品加工技術領域。按如下步驟制備：(1)將硒礦石通亞硫酸溶液浸泡溶解硒元素；(2)磷酸鹽溶液沉降處理重金屬，過濾，調節濾液pH＝6.5-7.5；(3)加入荻葦生長所必需的氮、磷、鉀等微量元素得到富硒培養液；(4)荻葦幼苗置于培養槽中，放置光照充足通風處培養至筍高25cm左右。

然而，荻對于土壤修復還存在一定的局限性，例如，雖然荻對重金屬具有較強的耐性，但由于其不能把較多的重金屬轉移到地上部，而不能有效的用于植物修復。建立荻轉基因技術是一種很好的快速培育荻抗逆新品種的方法。例如，公開號為CN102239808A的中國發明專利申請文獻公開了荻的組織培養基及組培方法，組培方法經過如下五個步驟：一是外植體的采集與消毒，二是初代培養，三是不定芽誘導，四是不定芽增殖培養，五是生根誘導。并公開了分別用于初代培養、不定芽誘導、不定芽增值培養基生根誘導的4中培養基。

由于轉化方法成熟、轉化效率高和操作簡單等優點，農桿菌轉化法已成為應用最廣泛的植物轉化方法。然而，截止到目前，還沒有關于采用農桿菌介導荻愈傷組織轉基因技術的報道。

發明內容

本發明提供了一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法及應用，為通過轉基因技術培育荻抗逆新品種奠定了基礎。

一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，包括如下步驟：

(1)選取荻成熟種子，消毒、清洗后依次進行愈傷組織誘導、繼代培養；

(2)將繼代培養后的胚性愈傷組織置于含有農桿菌菌液的侵染液中侵染，所述農桿菌菌液帶有表達載體；侵染后的胚性愈傷組織在共培養基上進行共培養；

(3)取共培養后的愈傷組織依次經無菌水和含羧卞青霉素的無菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的選擇培養基上進行篩選；

(4)將篩選得到的抗性愈傷組織移至分化培養基上，進行分化培養，誘導出不定芽；

(5)將分化出的不定芽移至生根培養基上，培養成完整植株。

荻成熟種子的消毒、清洗過程為：選取籽粒飽滿的荻種子，依次用75％的乙醇和30％的次氯酸鈉消毒，消毒結束后用無菌水清洗種子。

愈傷組織誘導過程為：將消毒的種子在無菌濾紙上晾干，接種到誘導培養基上，每皿20顆左右，用封口膜封好培養皿，在28℃光照培養箱培養40天。

繼代培養過程為：用鑷子挑選生長良好的胚性愈傷組織接種于繼代培養基上，在28℃光照培養箱繼代培養15天。

愈傷組織誘導和繼代培養基：MS培養基+6mg/L2,4-D+0.1mg/L6-芐氨基腺嘌呤+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝膠4g/L；pH5.8。

優選地，所述農桿菌為EHA105；所述表達載體為pCAMBIA1300。pCAMBIA1300的物理圖譜如圖1所示，該表達載體為空載體，載體上含有35S啟動子序列和hptII基因序列。

進一步地，步驟(2)中所述含農桿菌菌液的侵染液由如下方法制備：

挑取單個攜帶pCAMBIA1300載體的農桿菌菌落，接入到含有卡那霉素和鏈霉素的YEP液體培養基中，26～30℃過夜培養，得到OD600為0.8-1.0的菌液；取培養好的菌液離心收集菌體，用含乙酰丁香酮的侵染液重懸菌體，使重懸后的菌液OD600達到0.015～0.025，即得所述含農桿菌菌液的侵染液。