[發明專利]一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法及應用

在審

• 申請號: 201510401698.2
• 申請日: 2015-07-08
• 公開（公告）號: CN105039396A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 郭海朋;蔣德安;洪春桃;鄭炳松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 黃平英

1.一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)選取荻成熟種子，消毒、清洗后依次進行愈傷組織誘導、繼代培養；

(2)將繼代培養后的胚性愈傷組織置于含有農桿菌菌液的侵染液中侵染，所述農桿菌菌液帶有表達載體；侵染后的胚性愈傷組織在共培養基上進行共培養；

(3)取共培養后的愈傷組織依次經無菌水和含羧卞青霉素的無菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的選擇培養基上進行篩選；

(4)將篩選得到的抗性愈傷組織移至分化培養基上，進行分化培養，誘導出不定芽；

(5)將分化出的不定芽移至生根培養基上，培養成完整植株。

2.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，進行愈傷組織誘導的培養基組成為：以MS培養基為基礎添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝膠；pH5.8。

3.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，所述表達載體為pCAMBIA1300。

4.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，步驟(2)中在侵染液中侵染的時間為5-10min。

5.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，共培養基的組成為：以MS培養基為基礎培養基，添加1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆醇、10mg/L鹽酸硫脘素、0.1g/L肌醇、3.9g/L2-(N-嗎啡啉)乙磺酸、0.5g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝膠；pH5.8；高壓滅菌冷卻至55℃時加入乙酰丁香酮至終濃度為200μM。

6.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，步驟(3)中利用選擇培養基進行兩輪篩選：

所述選擇培養基的組成為：以MS培養基為基礎培養基，添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝膠；pH5.8；第一輪篩選的選擇培養基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二輪篩選的選擇培養基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。

7.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，所述分化培養基的組成為：以MS培養基為基礎添加0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝膠；pH5.8。

8.根據權利要求1所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，其特征在于，所述生根培養基的組成為：以1/2MS培養基為基礎培養基，添加0.4mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝膠；pH5.8。農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法。

9.一種如權利要求1～8任一權利要求所述農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法在培育荻轉基因植株上的應用。