[發(fā)明專利]一種快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510401246.4
• 申請日: 2015-07-10
• 公開（公告）號: CN105018351A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭慶霞;魏攀;周會娜;劉萍萍;王燃;翟妞;孟慶華;金立鋒;陳霞;陳千思;楊軍;林福呈
• 申請（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，屬于微生物學領(lǐng)域。

背景技術(shù)

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物內(nèi)部，而不引起宿主植物明顯癥狀的菌，可以通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離出來，也可以通過擴增出其DNA的方法證明其存在。植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成部分，包括內(nèi)生真菌（Endophtyic?fungi）和內(nèi)生細菌（Endophtic?bacteria）。內(nèi)生真菌與植物在長期進化過程中形成一種共生或互生的關(guān)系，即內(nèi)生真菌從宿主汲取生存的養(yǎng)分，同時又在宿主植物的生長發(fā)育和抗外界侵襲方面做出貢獻，甚至可以間接影響宿主植物的生態(tài)地位和系統(tǒng)演化過程。有研究顯示，感染內(nèi)生真菌的植物往往具有生長快、耐受性強和抗病蟲害等優(yōu)勢，同時內(nèi)生真菌還能增加宿主植物次生代謝的生成量。

煙草內(nèi)生真菌是與煙草（Nicotinana?tabacum）有互利共生關(guān)系的生態(tài)類群，是煙田微生物群落的重要成員。煙草內(nèi)生真菌不僅能促進煙草生長，增強抗病蟲能力，還具有降低煙草亞硝胺含量，改善煙葉品質(zhì)的積極作用。因此，煙草內(nèi)生真菌的研究及開發(fā)對闡明煙草內(nèi)生真菌的種類、分布特點，提高煙葉品質(zhì)具有重要意義。

現(xiàn)有關(guān)于植物內(nèi)生真菌的文獻報道主要集中在醫(yī)藥方向和農(nóng)業(yè)方向，尤其是以生物醫(yī)藥開發(fā)為目標的藥用植物內(nèi)生真菌方面，但是存在“初步研究多，深入追究少”的特點。目前關(guān)于煙草內(nèi)生真菌的研究報道相對較少，缺乏統(tǒng)一的分離、培養(yǎng)與鑒定體系，而且大多數(shù)停留在功能篩選上，對分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌從比較全面、深入的角度進行分類學研究較少。因此，建立并完善煙草內(nèi)生真菌的分離、培養(yǎng)與鑒定體系有助于提供煙草內(nèi)生真菌與煙草之間相互作用關(guān)系及其生物功能的新信息，為系統(tǒng)剖析煙草內(nèi)生菌的多樣性與功能性提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)狀而提供的一種快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，從新鮮煙葉中分離、培養(yǎng)并鑒定煙草內(nèi)生真菌，去除非生物雜質(zhì)，盡可能完整的保存煙草內(nèi)生真菌的多樣性，是進行煙草內(nèi)生真菌研究的前提。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及一種快速分離、純化與鑒定新鮮煙葉中內(nèi)生真菌的方法，主要包括煙葉表面消毒、切片培養(yǎng)、菌絲的分離純化、菌絲DNA的提取、PCR擴增真菌的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的測序、序列的比對鑒定等步驟，具體步驟如下：

（1）用無菌水浸泡新鮮煙葉并洗滌，除去煙葉表面雜質(zhì)。

（2）將步驟1中處理煙葉用75%乙醇浸泡消毒2～3?min，并用無菌水洗滌（2～3次）除去乙醇。

（3）檢驗步驟2中消毒是否徹底：取最后一次清洗煙葉上乙醇的無菌水，利用涂布法涂平板培養(yǎng)，看是否有雜菌長出。若有無雜菌長出則消毒徹底；若有雜菌長出，則消毒不徹底，需重復消毒。

（4）將步驟2中煙葉去除葉片邊緣，切成0.5×0.5?cm小塊放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為：葡萄糖40?g/L,?蛋白胨10?g/L，酵母粉10?g/L，瓊脂15～20?g/L，20～30萬單位/L的青霉素。。

（5）將步驟4中的煙葉與培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱，25℃恒溫培養(yǎng)。

（6）觀察步驟5中煙草內(nèi)生菌生長狀態(tài)，待切口處長出菌絲后，將菌絲在新鮮培養(yǎng)基中利用平板劃線法進一步純化，連續(xù)分離3～5次即可得到表面形態(tài)一致的煙草內(nèi)生真菌。

（7）觀察記錄步驟6中獲得的煙草內(nèi)生真菌菌落形態(tài)，并對菌株編號。將一部分純化的菌絲在無菌條件下利用接種針挑入已滅菌的20%甘油水溶液中，-20℃保存留種；另一部分冷凍干燥后備用。

（8）取?0.1?g步驟7中冷凍干燥后的菌絲放入預先加入液氮的研缽中，充分研磨，再轉(zhuǎn)移到1.5?mL?Eppendorf管中，加入0.1?mL?10%的SDS、0.3?mL氯化芐，劇烈振蕩使之成乳狀。

（9）在50℃水浴鍋中保溫1?h，每隔10?min振蕩混合1次。

（10）加入0.3?mL?3?mol/L?NaAc（pH5.2），冰水浴15?min，4℃下12000?r/min離心10?min，取上清液至一個已滅菌的新Eppendorf管中。

（11）加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）和苯酚，其中氯仿-異戊醇和苯酚體積各半，振蕩搖勻。4℃下12000?r/min離心10?min，取上清至另一個已滅菌的新Eppendorf管中。