[發(fā)明專利]一種快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510401246.4
• 申請(qǐng)日: 2015-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105018351A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭慶霞;魏攀;周會(huì)娜;劉萍萍;王燃;翟妞;孟慶華;金立鋒;陳霞;陳千思;楊軍;林福呈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，其特征在于：包括煙葉表面消毒、切片培養(yǎng)、菌絲的分離純化、菌絲DNA的提取、PCR擴(kuò)增真菌的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的測(cè)序、序列的比對(duì)鑒定，具體步驟如下：

（1）用無(wú)菌水浸泡新鮮煙葉并洗滌，除去煙葉表面雜質(zhì)；

（2）將步驟1中處理煙葉用75%乙醇浸泡消毒2～3?min，并用無(wú)菌水洗滌2～3次除去乙醇；

（3）檢驗(yàn)步驟（2）中消毒是否徹底：取最后一次清洗煙葉上乙醇的無(wú)菌水，利用涂布法涂平板培養(yǎng)，看是否有雜菌長(zhǎng)出，若有無(wú)雜菌長(zhǎng)出則消毒徹底；若有雜菌長(zhǎng)出，則消毒不徹底，需重復(fù)消毒；

（4）將步驟（2）中煙葉去除葉片邊緣，切成0.5×0.5?cm小塊放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

（5）將步驟（4）中的煙葉與培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱，25℃恒溫培養(yǎng)；

（6）觀察步驟（5）中煙草內(nèi)生菌生長(zhǎng)狀態(tài)，待切口處長(zhǎng)出菌絲后，將菌絲在新鮮培養(yǎng)基中利用平板劃線法進(jìn)一步純化，連續(xù)分離3～5次即可得到表面形態(tài)一致的煙草內(nèi)生真菌；

（7）觀察記錄步驟（6）中獲得的煙草內(nèi)生真菌菌落形態(tài)，并對(duì)菌株編號(hào)，將一部分純化的菌絲在無(wú)菌條件下利用接種針挑入已滅菌的20%甘油水溶液中，-20℃保存留種；另一部分冷凍干燥后備用；

（8）取?0.1?g步驟（7）中冷凍干燥后的菌絲放入預(yù)先加入液氮的研缽中，充分研磨，再轉(zhuǎn)移到1.5?mL?Eppendorf管中，加入0.1?mL?10%的SDS、0.3?mL氯化芐，劇烈振蕩使之成乳狀；

（9）在50℃水浴鍋中保溫1?h，每隔10?min振蕩混合1次；

（10）加入0.3?mL?3?mol/L?pH?5.2的?NaAc，冰水浴15?min，4℃下12000?r/min離心10?min，取上清液至一個(gè)已滅菌的新Eppendorf管中；

（11）加入等體積的氯仿-異戊醇和苯酚，其中氯仿-異戊醇和苯酚體積各半，振蕩搖勻；4℃下12000?r/min離心10?min，取上清至另一個(gè)已滅菌的新Eppendorf管中，所述氯仿-異戊醇的比例為24:1；

（12）重復(fù)步驟（11），然后加入1/10體積的3?mol/L?NaAC和等體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕上下混勻，可見(jiàn)有絮狀沉淀析出，置入-20℃冰箱15～17?h，使DNA充分沉淀；

（13）4℃下12000?r/min離心10?min，收集沉淀，加入75%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀兩次；

（14）吸除乙醇，在通風(fēng)櫥中干燥10～15?min，加入30～50?μL?TE緩沖液溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（15）檢測(cè)DNA的純度和濃度；

（16）以提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增真菌的ITS-rDNA基因；

如果PCR擴(kuò)增出特異性目的條帶，將該目的條帶膠回收，與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序；

（17）將所測(cè)序列在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)，對(duì)煙草內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，其特征在于：步驟（4）中的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖40?g/L,?蛋白胨10?g/L，酵母粉10?g/L，瓊脂15～20?g/L，20～30萬(wàn)單位/L的青霉素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，其特征在于：在步驟（15）中，利用NanoDrop?2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、鑒定煙草內(nèi)生真菌的方法，其特征在于：步驟（16）中的PCR反應(yīng)體系如下，以50?μL反應(yīng)體系為例：

反應(yīng)物體積終濃度DNA模板Variable As required10× PCR BufferⅠ5 μL1×2.5 mmol/L dNTPs4 μL0.2 mmol/LHiFi酶0.5～1 μL2.5～5 units上游引物（10 μmol/L）1～2 μL0.2～0.4 μmol/L下游引物（10 μmol/L）1～2 μL0.2～0.4 μmol/LddH₂OVariable—總體積50 μL—

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?s，65℃退火30?s，72℃延伸45?s，共運(yùn)行30～35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10?min；4℃保存。