[發明專利]一種人NGAL蛋白重組表達及制備方法

在審

• 申請號: 201510399897.4
• 申請日: 2015-07-08
• 公開（公告）號: CN104988171A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 孔毅榮;李小紅;劉強;于海雙
• 申請（專利權）人: 北京嘉萬生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/47;C07K1/18;C07K16/18;C07K16/06
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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的重組表達及制備方法。

背景技術

NGAL(neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin)蛋白首先由Kjelden等人于1993年在中性粒細胞內發現，其與炎癥、免疫應答、胚胎發育、信號轉導及多種腫瘤的發生與發展過程相關。越來越多的研究結果提示NGAL可能是一種重要的炎癥或腫瘤標志物。

研究表明，在一些炎癥性疾病中，NGAL表達上調，是一種急性期反應蛋白。尤其NGAL與腎臟的一些炎癥性疾病相關，是診斷急性腎損傷的重要生物學指標，對判斷與監測病情變化有顯著的意義。血液與尿液中的NGAL的檢測對判斷急性腎損傷是預測性的生物學指標。

NGAL蛋白是由一條多肽鏈構成的糖蛋白，其分子量為25kD，在大腸桿菌表達系統中以大部分包涵體形式表達。在本發明中，將NGAL與TF(Trigger?factor)蛋白融合表達，融合蛋白以可以溶性形式表達，為避免大的標簽蛋白對NGAL免疫原性的影響，采用蛋白酶酶切后純化的方法去除標簽蛋白，所得的重組NGAL蛋白仍以可溶性形式存在，并且具有很好的免疫原性。

發明內容

本發明公開了一種具有天然活性的重組NGAL蛋白的表達及制備方法。該方法通過構建重組NGAL原核表達載體，轉化表達宿主菌，誘導菌體表達，收集菌體及純化獲得重組表達的NGAL融合蛋白。NGAL融合蛋白含有蛋白的的酶切位點，將獲得的NGAL融合蛋白進行蛋白酶酶切處理，然后用陰離子交換柱純化，從而最終獲得天然NGAL大小的目的蛋白。本發明利用大腸桿菌表達系統進行重組表達，制備的重組NGAL融合蛋白具有很好的可溶性，可以大量生產，經過蛋白酶酶切處理后獲得的天然NGAL大小的重組蛋白具有與天然NGAL一致的免疫原活性，其為人NGAL槍測試劑盒的研發提供了原料。

本發明還公開了使用上述方法獲得的重組人NGAL蛋白在制備NGAL單克降抗體、多抗血清及人NGAL槍測試劑中的應用。

附圖說明

圖1是本發明制備人重組NGAL蛋白的流程示意圖；

圖2是本發明制備重組NGAL融合蛋白過程的SDS-PAGE電泳圖：1、菌體超聲沉淀；2、菌體超聲上清；3、Ni²⁺螯合親和柱純化NGAL融合蛋白；4、蛋白酶酶切NGAL融合蛋白；5、Q離子柱洗脫TF蛋白；6、Q離子柱流穿NGAL蛋白；

圖3是使用本發明的方法獲得的重組NGAL蛋白免疫兔子所制備的兔多抗的效價檢測；

圖4是制備兔多抗配制的人NGAL槍測試劑的檢測結果；

圖5是使用本發明的方法獲得的重組NGAL蛋白免疫兔子所制備的單克降抗體的效價槍測。

具體實施方式

實施例1：重組NGAL融合蛋白表達載體的構建

取5μg?pUC57-NGAL質粒(由南京金斯瑞公司合成基因所構建質粒)，建立50μl的雙酶切體系，具體如下：5μg的質粒，5μl的10×T酶切反應緩沖液，1.5μl?Nde?I和1.5μl?Xba?I，加雙蒸水至總體積50μl，37℃水浴中反應6小時。瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，切下NGAL片段，使用凝膠回收試劑盒(OMEGA?BIO-TEK)進行回收。

取600ng的pCold^TM?TF?DNA(Takara)，建立50μl的雙酶切體系，具體如下：600ng的pCold^TM?TF?DNA質粒，5μl的10×T酶切反應緩沖液，1.5μl?Nde?I和1.5μl?Xba?I，加雙蒸水至總體積50μl，37℃水浴中反應6小時。使用凝膠回收試劑盒(OMEGA?BIO-TEK)純化pCold^TM?TF?DNA質粒的雙酶切產物。

連接反應：取4μl經過純化的pCold^TM?TF?DNA的Nde?I和Xba?I雙酶切產物，加入6μl經過純化的NGAL雙酶切產物，1μl的T4?DNA連接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4?DNA連接酶反應緩沖液，16℃水浴中連接過夜。

連接產物轉化大腸桿菌DH5α，然后挑取單克隆送公司測序(感受態DH5α的制備方法及轉化方法依照“分子克降實驗指南”第二版所述。J.薩姆布魯克著)。所得重組質粒命名為pCold?TF-NGAL。

實施例2：NGAL融合蛋白的表達及純化