[發明專利]蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法

有效

• 申請號: 201510399365.0
• 申請日: 2015-07-09
• 公開（公告）號: CN105192246B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 趙玉勤;徐銀峰;王斌;陳蔭;孫坤來
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;A23J3/04;A23J3/34
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 徐佳晶

本發明涉及一種蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法，具體講是以蝦仁加工下腳料為原料，采用酸法提取膠原蛋白，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對膠原蛋白進行酶解，采用超濾、大孔樹脂柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到鋅螯合膠原肽。鋅螯合膠原肽由于其獨特的螯合和轉運機制，吸收利用度高，又可同時補充多肽/氨基酸和鋅，是一種理想的補鋅物質。

技術領域

本發明屬于水產品精深加工技術領域，涉及一種離子螯合肽的制備方法，尤其涉及蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法。

背景技術

我國的蝦類資源非常豐富，近年來隨著蝦仁加工業的迅速發展，產生了大量的加工下腳料，這些下腳料中富含蛋白質、甲殼素以及蝦青素等有效物質。經調查發現，我國以蝦為主要原料的生產企業在處理蝦類加工下腳料時，一部分以極低價格作為廢料外售，或者運送到養殖場烘干粉碎作為飼料，還有很多未來得及處理的下腳料由于堆砌一處發霉腐爛，最終直接運往垃圾場。不但造成嚴重的資源浪費，而且還會引起環境污染。國外對蝦加工下腳料的綜合利用非常重視，并進行了深入的研究，在理論和實踐方面均取得了系列成果，為我國蝦仁加工下腳料的回收利用提供了依據。近年來，我國隨著對環境保護的加強，蝦仁加工下腳料的回收利用成為水產加工企業迫切需要解決的問題。目前我國主要還是用于生產甲殼素，對于蛋白和蝦青素的回收利用由于成本高尚實現工業化生產。

經檢索，以蝦仁加工下腳料制備鋅螯合肽未見報道。基于此，本發明根據鋅螯合肽和蝦仁加工下腳料的研究現狀，提供一種具有金屬鋅螯合活性的多肽，并提供這種鋅螯合肽的制備方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種鋅離子螯合效果好的蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法。

本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為：一種蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）蝦仁加工下腳料蛋白酶解物的制備：將冷凍蝦仁加工下腳料（蝦頭和蝦殼）用組織搗碎機粉碎，按照料液比1 g：4～5 mL加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.5～7.5），于45～50℃下于超聲功率400～500W下超聲60～90 min，然后加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×10⁴ U/g），于45～50℃保溫2～3 h后，溫度升至90～95℃并保持10～15 min；溶液溫度降至37～40℃，pH調至 7.5～8.0，加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×10⁴ U/g）保溫2～3 h后，溫度升至90～95℃并保持10～15 min后，于9 000 ～10 000g離心15～20 min，得上清液，即蝦仁加工下腳料蛋白酶解物。

2）蝦仁加工下腳料鋅螯合肽的制備：將制備的酶解物采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有8～10倍NKA-9大孔樹脂的層析柱中，用2～3倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用3～5倍柱體積的30%和60%乙醇進行洗脫，收集60%乙醇洗脫液，于50 ℃以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜（RP-HPLC）純化，得到蝦仁加工下腳料鋅螯合肽。

作為優選，固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為：

固定化鋅離子層析柱層析：將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10～20 mg/mL的溶液，以0.5～1.5 mL/min的流速通過固定化鋅離子親和層析柱，分別用3～5柱體積的水和0.1 mol/L NaCl洗脫，收集0.1 mol/L NaCl洗脫組分，即為親和層析組分。

凝膠柱層析：將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10～20 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰為凝膠層析酶解物。