[發明專利]蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法

有效

• 申請號: 201510399365.0
• 申請日: 2015-07-09
• 公開（公告）號: CN105192246B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 趙玉勤;徐銀峰;王斌;陳蔭;孫坤來
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;A23J3/04;A23J3/34
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 徐佳晶

1.蝦仁下腳料鋅螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)蝦仁加工下腳料蛋白酶解物的制備：將蝦仁加工下腳料用組織搗碎機粉碎，按照料液比1g：4～5mL加入磷酸鹽緩沖液，于45～50℃下于超聲功率400～500W下超聲60～90min，然后加入中性蛋白酶，于45～50℃保溫2～3h后，溫度升至90～95℃并保持10～15min；溶液溫度降至37～40℃，pH調至7.5～8.0，加入胰蛋白酶，保溫2～3h后，溫度升至90～95℃并保持10～15min后，于9000～10000g離心15～20min，得上清液，即蝦仁加工下腳料蛋白酶解物；所述的蝦仁加工下腳料含有蝦頭或蝦殼；所述的磷酸鹽緩沖液為0.2mol/L，pH6.5～7.5；

2)蝦仁加工下腳料鋅螯合肽的制備：將制備的蛋白酶解物采用3kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有8～10倍NKA-9大孔樹脂的層析柱中，用2～3倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用3～5倍柱體積的30％和60％乙醇進行洗脫，收集60％乙醇洗脫液，于50℃以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化制備氨基酸序列為Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met、ESI/MS檢測分子量為1027.20Da的蝦仁加工下腳料鋅螯合肽；

所述的反相高效液相色譜純化制備具有如下步驟：

①固定化鋅離子層析柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10～20mg/mL的溶液，以0.5～1.5mL/min的流速通過固定化鋅離子親和層析柱，分別用3～5柱體積的水和0.1mol/L NaCl洗脫，收集0.1mol/L NaCl洗脫組分，即為親和層析組分；

②凝膠柱層析：將親和層析組分溶于雙蒸水配成濃度為10～20mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據214nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰為凝膠層析酶解物；

③RP-HPLC純化：將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45～55μg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化；

所述RP-HPLC條件為：進樣量8～10μL；色譜柱為Zorbax C18；流動相：15％乙腈；洗脫速度0.5～0.8mL/min；紫外檢測波長220nm；

根據對Zn的螯合活性得1個高Zn螯合活性膠原肽；

④結構檢測：Zn螯合膠原肽經檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS檢測分子量為1027.20Da。