[發明專利]一種凝血酶的制備方法

有效

• 申請號: 201510397110.0
• 申請日: 2015-07-08
• 公開（公告）號: CN105002153B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 黃耀江;蔣丹;劉宇;閆強;商宇
• 申請（專利權）人: 黃耀江
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李敏

本發明公開了屬于生物工程技術領域的一種凝血酶的制備方法。該方法利用殼聚糖?精氨酸陰離子樹脂加入抗凝血漿中吸附凝血酶原，將凝血酶原激活后，用肝素?殼聚糖親和磁性微球進行親和層析分離。該方法采用殼聚糖?精氨酸陰離子樹脂吸附凝血酶原，吸附效果較好，采用肝素?殼聚糖親和磁性微球進行凝血酶特異性純化，純化速度快，酶活性高，純化后的凝血酶比活性最高可為1928.7IU/mg，肝素?殼聚糖親和磁性微球經處理后可重復利用。本發明的方法工藝流程簡單，在常溫常壓下進行即可，并且可以應用于大規模生產，生產周期短、操作簡單、整個工藝生產僅需2天。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種凝血酶的制備方法。

背景技術

凝血酶是具有高度專一性的絲氨酸蛋白水解酶，能直接促使血液中的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，并促使血小板聚集，達到迅速止血的目的。凝血酶由血液中的凝血酶原(prothrombin)前體水解活化而來，凝血酶產品由提取的凝血酶原活化而來。20世紀中期開始人們將凝血酶應用于臨床，由于其療效顯著，應用也越來越廣泛。之后證明將動物凝血酶應用于人體未出現凝血酶抗原性，口服和局部外用時無過敏反應和其他不良反應等。從血漿中提取的凝血酶可應用于臨床，作為局部止血的首選藥物，具有止血快、無副作用的優點。同時，凝血酶也是纖維蛋白原定量檢測試劑盒的主要成分，應用于出凝血疾病和血栓性疾病的臨床檢測。

目前，一般從牛、豬和人的血漿中制備凝血酶，對凝血酶的分離純化主要包括有血漿的前處理、提取和激活凝血酶原、制備凝血酶粗酶和凝血酶的純化等步驟。凝血酶原的提取方法主要有等電點法、檸檬酸鋇沉淀法、氫氧化鎂吸附法和離子交換吸附法。凝血酶進行純化的方法目前主要有鹽析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等。

等電點沉淀法根據蛋白質在溶液pH為其等電點的條件下溶解度最低的原理，用1％的醋酸將適當稀釋后的血漿pH調至凝血酶原的等電點5.0-5.5之間，即可使凝血酶原析出。該方法雖然操作簡便，成本較低，但得到的凝血酶含雜蛋白較多，比活性低。檸檬酸鋇吸附法則根據檸檬酸鋇能吸附依賴于維生素K的凝血因子這一特性，在檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入氯化鋇產生檸檬酸鋇，凝血酶原等因子隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸附，離心去沉淀，上清液經透析后獲得凝血酶原溶液。該方法提取凝血酶需要經過透析或過柱除去鋇鹽，工業化生產不易操作，生產周期長。

中國專利文獻(CN1031160486)公開了一種豬凝血酶的制備方法，該方法包括：首先分離豬血漿，將血漿進行化學法病毒滅活；按照豬血漿總重量的1.5％加入離子交換樹脂進行凝血酶原的吸附，在室溫下吸附40～60min后用濾布過濾收集離子交換樹脂，洗滌離子交換樹脂，棄去洗滌液。然后將經洗滌液洗滌的離子交換樹脂，用洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，將收集的洗脫液用截留分子量為10000道爾頓的超濾器進行透析，去除多余的鹽類物質，得到凝血酶原溶液，將凝血酶原溶液用孔徑為20nm的過濾器進行過濾，收集濾液進行凝血酶原活化制備凝血酶的凍干保存。其中所述的離子交換樹脂為DEAE-Sephadex A-50型離子交換樹脂。上述方法采用離子交換樹脂吸附凝血酶原后用透析去鹽，又經納米過濾，活化后沒有經過進一步純化直接制備凝血酶。

現有的制備方法，都是上述凝血酶原提取和凝血酶純化方法的各種組合，但是不論從動物血還是人血制備的凝血酶產品，現有的制備方法都會存在以下問題：凝血酶產率較低，效價不穩定；產品雜質偏高；這些都會限制凝血酶產品的臨床應用，并造成安全隱患，在制備過程中往往需要多次的純化，以達到純度較高的凝血酶。

發明內容

為此，本發明針對現有技術中制備出的凝血酶產率較低、產品雜質偏高、工藝步驟繁多等不足，提供一種工藝流程簡單、生產周期短、成本低、純度較高的新的制備凝血酶的方法。

為了解決上述技術問題，本申請的技術方案如下：

一種凝血酶的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)向血液中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；