[發明專利]一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應用

在審

• 申請號: 201510386064.4
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN104962631A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 任航;南海洋;張倩
• 申請（專利權）人: 黑龍江富航農業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應用，屬于植物分子標記開發和作物分子輔助選擇技術領域。

背景技術

大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經濟性狀。商品大豆油主要包括大約11％的軟脂酸(16:0)，4％的硬脂酸(18:0)，25％的油酸(18:1)，52％的亞油酸(18:2)和4％的亞麻酸(18:3)(Fehr，2007)。中國各地區的氣候、土壤、水質等自然條件以及品種選育方向均存在差異，為大豆種質資源品質特性的豐富變異創造了條件，有利于篩選優異脂肪酸組成的大豆種質(蓋均鎰等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需脂肪酸，在人體新陳代謝中具有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害膽固醇含量，營養學家稱之為“安全脂肪酸”，亞油酸具有抑制癌癥，預防糖尿病和減少體內脂肪，減少血液中膽固醇量，防止動脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝集，健腦抗衰老等作用(陳學珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不飽和脂肪酸中油酸的穩定性最好，提高其含量可以延長貯藏期，但由于亞油酸和亞麻酸分別含有2，3個不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質，造成豆油及其食品味道不佳，營養價值降低。另外，由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過多食用會導致肥胖病和心血管疾病(楊柳等，2006)。因此，提高油酸含量，降亞油酸含量是大豆品質育種的重要目標之一。

在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氫酶2(FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉變過程中起到了至關重要的作用(Okuley等，1994；Schlueter等，2007)，在發育的大豆種子中，2個脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-1A(Glyma10g42470)和GmFAD2-1B(Glyma20g24530)表達水平最高，因此這2個基因被認為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來越多的研究者通過改造這2個目標基因來培育高油酸含量的優質大豆品種。基因工程和候選基因分子育種策略被用來培育高于80％油酸含量的優質大豆(Buhr等，2002；Hoshino等，2010；Pham等，2010)，這些研究成果證明了在GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因中的突變程度越嚴重，大豆油脂中的油酸含量越高，同時油脂的穩定性也越強。

我國作為大豆的發源地，具有豐富的大豆種質資源。目前，我國作物種質資源庫己保存的大豆種質資源達3萬余份，居世界之首(汪越勝，2002)。然而利用傳統的油分鑒定方法對數目龐大的大豆資源進行鑒定工作量大，周期長，目前尚沒有一種能夠快速并且準確地檢測控制大豆高油酸含量的B1型突變位點的方法。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組，所采取的技術方案如下：

本發明的一個目的在于提供一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組，該引物組的核苷酸如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.5所示。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述引物組快檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的方法，該方法是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產物后，再以稀釋后的擴增產物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.5所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物進行基因型突變檢測。

所述方法的步驟如下：

1)提取待鑒定材料的DNA；

2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR巢式擴增，獲得擴增產物后，進行稀釋處理；

3)以步驟2)中稀釋后的擴增產物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.5所述序列為引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增結束后獲得第二輪擴增產物；

4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產物覆蓋成混合樣品，再利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物的基因型突變進行檢測。

優選地，步驟2)所述第一輪巢式PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環，再72℃延伸4min，4℃保溫；所述稀釋處理，是利用ddH₂O稀釋10倍。