[發明專利]一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應用

在審

• 申請號: 201510386064.4
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN104962631A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 任航;南海洋;張倩
• 申請（專利權）人: 黑龍江富航農業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

1.一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組，其特征在于，核苷酸如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.5所示。

2.一種利用權利要求1所述引物組檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的方法，其特征在于，是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產物后，再以稀釋后的擴增產物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.5所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物進行基因型突變檢測。

3.權利要求2所述方法，其特征在于，步驟如下：

1)提取待鑒定材料的DNA；

2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR巢式擴增，獲得擴增產物后，進行稀釋處理；

3)以步驟2)中稀釋后的擴增產物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.5所述序列為引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增結束后獲得第二輪擴增產物；

4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產物覆蓋成混合樣品，再利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物的基因型突變進行檢測。

4.權利要求3所述方法，其特征在于，步驟2)所述第一輪巢式PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環，再72℃延伸4min，4℃保溫；所述稀釋處理，是利用ddH₂O稀釋10倍。

5.權利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)所述第二輪巢式PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性40s，56.8℃退火30s，72℃延伸10s，共15個循環，再72℃延伸4min，4℃保溫。

6.權利要求3所述方法，其特征在于，步驟4)所述利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物的基因型突變進行檢測，是根據目標片段的GC含量的變化在不同熔解溫度出現吸收峰的位置判定，突變株的GC含量下降，熔解溫度降低，吸收峰在左側；野生型GC含量增加，熔解溫度升高，吸收峰在右側；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。

7.權利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)提取待鑒定材料的DNA；

2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR巢式擴增，擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環，再72℃延伸4min，4℃保溫；所述稀釋處理，是利用ddH₂O稀釋10倍；

3)以步驟2)中稀釋后的擴增產物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.5所述序列為引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性40s，56.8℃退火30s，72℃延伸10s，共15個循環，再72℃延伸4min，4℃保溫，擴增結束后獲得第二輪擴增產物；

4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產物覆蓋成混合樣品，再利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產物的基因型突變進行檢測，并將所得熔解曲線與野生型和雜合型樣品的熔解曲線進行對比，當待測樣品的熔解溫度降低，熔解曲線位于野生型和雜合型樣品的左側時，該待測樣品即為B1型突變株。

8.權利要求3-7所述任一方法，其特征在于，用于大豆的遺傳育種。

9.利用權利要求1所述引物組制備的檢測試劑盒。

10.權利要求9所述試劑盒，其特征在于，用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變體。