[發(fā)明專利]一種向日葵黃萎病的兩種輪枝病菌的多重DPO?PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510380096.3
• 申請日: 2015-07-01
• 公開（公告）號: CN104946637B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 乾義柯;魏霜;張娜;梁巧玲;陳衛(wèi)民;陸平;易建平;賽鐵爾汗;劉中勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局;伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,白艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種向日葵黃萎病的兩種輪枝病菌的多重DPO-PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

向日葵黃萎病主要是由大麗輪枝菌(Vertieillium dahliae Kleb.)和黑白輪枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)引起，雖然有報(bào)道稱從向日葵黃萎病株上分離的大部分是大麗輪枝菌，但仍有報(bào)道證明黑白輪枝菌也是引起向日葵黃萎病的一種重要病原菌。大麗輪枝菌和黑白輪枝菌均為我國進(jìn)境檢疫性有害生物，親緣關(guān)系非常近，兩種菌的ITS序列同源性高達(dá)99.40％。因此對分離自向日葵黃萎病株的兩種真菌類別進(jìn)行鑒定顯得非常重要，而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定這兩種菌周期長、時(shí)效性差。利用血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定這兩種菌的方法已有建立，包括PCR、RFLP、RAPD等。但這些方法有些需要酶切，檢測過程復(fù)雜；有些特異性不強(qiáng)或?qū)σ蕾囕^昂貴的儀器設(shè)備，都難以在實(shí)驗(yàn)室之間推廣。因此，建立一種特異性強(qiáng)、且能同時(shí)快速區(qū)分這兩種菌的檢測方法顯得非常重要。

DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技術(shù)的主要原理為其引物包含兩個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18-25個(gè)堿基組成并與靶基因序列配對，3′端序列由6-12個(gè)堿基用來引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine,I)進(jìn)行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使5′和3′區(qū)域形兩個(gè)獨(dú)立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，并且研究表明5′和3′引物區(qū)域中任何有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行，而且由于其特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物之間很少形成二級結(jié)構(gòu)且對退火溫度不敏感。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要在于它對退火溫度、鎂離子濃度等影響普通多重PCR的關(guān)鍵因素不敏感，適用范圍廣，而且該技術(shù)特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，為多重PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的引物組。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的引物組由引物1、引物2、引物3和引物4組成：

所述引物1為SEQ ID No.1所示的單鏈DNA分子；

所述引物2為SEQ ID No.2所示的單鏈DNA分子；

所述引物3為SEQ ID No.3所示的單鏈DNA分子；

所述引物4為SEQ ID No.4所示的單鏈DNA分子。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的PCR試劑。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的PCR試劑包括上述引物組。

上述PCR試劑，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR試劑中的終濃度均為0.4μmol/L。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的試劑盒包括上述引物組或上述PCR試劑。

上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在區(qū)分或輔助區(qū)分黑白輪枝菌和大麗輪枝菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的方法。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌包括如下步驟：

(1)用上述引物組對待測菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(2)檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。?!-- SIPO -->

若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為151bp的片段，則待測菌株為或候選為黑白輪枝菌；

若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為225bp的片段，則待測菌株為或候選為大麗輪枝菌。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測菌株的基因組DNA；所述待測菌株來源于向日葵、苜蓿、棉花、茄子、番茄、辣椒或馬鈴薯。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增為多重DPO-PCR。