[發明專利]一種谷物粉狀食品中稻米成分的HDA檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510380048.4
• 申請日: 2015-06-27
• 公開（公告）號: CN104894287A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 張帆濤;謝建坤;羅向東;周毅
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及一種檢測谷物粉狀食品中稻米成分的HDA檢測方法及試劑盒。

技術背景

隨著人們生活水平的日益提高，以及生活節奏的加快，越來越多的谷物粉狀食品出現在人們的日常生活中。稻米在未加工前有特異的形態特征，容易與其它谷物進行區分，但是如果將稻米制成粉狀，與其它粉狀的谷物相混合，則不易辨別。一些假冒偽劣商品標注含有稻米成分，可能不含稻米成分，而用其它谷物代替；而一些標注不含稻米成分的商品，卻可能添加了稻米成分。從谷物粉狀食品中檢測稻米成分是食品檢測與監督執法的一項任務。

目前谷物粉狀食品成分的檢測方法主要包括：感官法、化學法和近紅外光譜分析法。

利用感官法從不同谷物粉狀混合物中準確鑒定稻米成分難度較大，存在人為判斷錯誤，不具有科學性和說服力。利用化學法檢測谷物成分是利用不同的化學試劑和谷物成分進行反應，從而對其成分進行檢測和鑒定。谷物的化學成分一般都包括蛋白質、淀粉、脂類和無機鹽等。不同種類的谷物具有相似的化學成分，所以利用該方法從谷物粉狀混合物中檢測稻米成分靈敏性和特異性較差。近紅外光譜分析法是目前較為常用的一種食品檢測方法。該方法雖能對谷物成分進行檢測，但儀器要求較高，需要足夠的專業知識建立模型才能進行分析，較為復雜；此外，對于不同種類的谷物混合粉狀樣品而言，測定時存在的背景干擾也可能會影響檢測結果。

依賴解旋酶DNA等溫擴增技術（Helicase-Dependent?isothermal?DNA?Amplification，簡稱HDA）是由美國NEB公司于2004年發明一種核酸等溫擴增技術。該技術只需在恒定溫度下進行，不需要溫度變化的過程，因此，在實際操作和儀器要求方面，HDA技術都比普通核酸擴增技術（PCR）更為簡單和廉價，使樣品的檢測實現了快速、簡便和高通量，從而更容易被開發出檢測的應用產品。

HDA技術原理是利用解旋酶在恒溫條件下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結合蛋白(SSB)穩定解開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈，新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入循環擴增反應，最終實現靶序列的指數增長。該技術的優點在于：等溫擴增，HDA技術在一個恒定溫度就能完成擴增反應，不需要像普通PCR那樣循環的溫度變化；操作簡便，HDA對引物的設計與普通PCR相似，不需要復雜的引物設計，對于其他反應組分也不需要做任何特殊處理；設備簡單，HDA反應不需要復雜的設備，只需要一個簡單的恒溫器就可進行。因此，HDA技術具有廣闊的應用前景。

目前尚未見利用HDA技術從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有檢測技術的不足，提供一種能夠簡單、準確、快速、高通量的從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的HDA檢測方法及試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供一種從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的HDA引物對，所述引物對序列為SEQ?ID?No:?1和SEQ?ID?No:?2所示的序列。

本發明還提供一種試劑盒，即含有SEQ?ID?No:?1和SEQ?ID?No:?2所示的引物對的試劑盒。

本發明所述檢測方法具體步驟為：

1、從待測樣品中提取DNA作為檢測的模板；

2、利用HDA引物對或者含引物對的試劑盒中的引物對，進行HDA反應，得到擴增產物；

3、檢測擴增產物，并作出判斷。

所述引物對序列為：

SEQ?ID?No：1：5’-AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3’；

SEQ?ID?No：2：5’-GAACCGCATGTTGTAAACGA-3’。

所述引物對由上海生工生物工程有限公司合成。

所述的HDA反應體系為：5?μL的10×緩沖液，0.2?μmol的ATP，0.1?μmol的dNTPs，10?U?Bst?polymerase，5?μg?RecA蛋白，0.2?μg?UvrD?helicase，25?μM海藻糖，2?μL的10?μmol/L的上游引物，2?μL的10?μmol/L的下游引物，2?μL的樣品基因組DNA，用ddH₂O補至50?μL。

所述的HDA反應方法為：將反應體系放入60-70^oC恒溫金屬浴中恒溫擴增2h。