[發明專利]一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法

在審

• 申請號: 201510377125.0
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN104988179A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 田莉莉;牛良
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明屬于農業生物技術育種技術領域，具體涉及一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法。

背景技術

葡萄是世界上最古老的果樹樹種之一，以其味美多汁、營養豐富及具有多種保健功能深受國內外消費者喜愛，近年來，國內外市場對鮮食葡萄品種的要求也越來越高，尤其是無核葡萄越來越受到人們的青睞，現有無核葡萄品種已不能滿足生產上的需求。同時，葡萄也是感染病毒種類最多的果樹樹種[Martelli等.Grapevine?virology?highlights：2010–2012.Proceedings?of?the17th?Congress?of?ICVG，Davis，California，USA，2012:13-31]。近年來，我國各地競相發展葡萄，地區間引種比較頻繁，病毒本身可隨苗木進行遠距離傳播，導致一些地方病害蔓延。據調查[劉曉等.部分葡萄品種的病毒病鑒定及健康狀況評價.果樹學報，2006，23(6):846-849]，我國多數主栽品種和砧木普遍帶毒，有些品種的帶毒株率幾乎達到100％。其中，葡萄扇葉病毒(GFLV)、葡萄卷葉病毒(GLRaV，主要病原是GLRaV-3)葡萄病毒A(GVA)和葡萄病毒B(GVB)是生產中最為廣泛存在的4種危險性病毒，目前，葡萄病毒病已成為我國果樹生產中亟待解決的問題，現有技術水平下全世界尚無有效的藥劑防治辦法，而培育抗病品種無疑是一條最為經濟有效的途徑。

現代葡萄育種的理論[Ramming等.Hybridization?of?seedless?grapes.Vitis,1990(Special?issue):439-444]認為，采用“無核×無核”葡萄品種間雜交，通過胚挽救的方法容易獲得無核后代，雜種后代中無核類型比例可達80％以上。目前，這種生物技術育種方法已成功應用于無核葡萄育種技術領域[田莉莉等.Seedless?grape?breeding?for?disease?resistance?by?using?embryo?rescue.Vitis，2008，47(1):15-19；田莉莉等.Breeding?of?disease-resistant?seedless?grapes?using?Chinese?wild?Vitis?spp.I.In?vitro?embryo?rescue?and?plant?development.Scientia?Horticulturae,2008,117(2):136-141]。同時，在植物抗病毒育種方面，利用植物外殼蛋白基因轉化植物是目前培育抗病品種的主要手段。近年來，RNAi技術的發展為植物轉基因抗病毒提供了新策略。前人的研究表明，轉化病毒外殼蛋白基因的全部或部分片段構建的RNAi載體，均能獲得抗病的轉基因植株[朱常香等.多抗PVY、TMV和CMV轉基因煙草的培育.中國農業科學，2008，41(4):1040-1047]。多數研究者在構建RNAi載體時，通常選取的是病毒基因組中相對保守的片段作為干擾片段，這樣還可以減少因病毒變異造成的轉基因植株抗病性的喪失[Xu等.Conserved?sequences?of?replicas?gene-mediated?resistance?to?Potyvirus?through?RNA?silencing.Journal?of?Plant?Biology,2009,52(6):550-559]。

目前普遍采用的胚挽救技術培育無核葡萄方法尚存在不足之處：由于生產上栽培的多數無核葡萄屬于歐亞種，雖然品質優良但抗病性普遍較差，通過胚挽救這一技術雖然容易獲得“無核×無核”的無核后代，但獲得的無核葡萄往往比親本更不抗病，更容易受到自然界中各種病毒的危害，因此，僅僅依靠胚挽救這一單一的生物技術手段獲得的無核葡萄，在抗病毒病方面存在很大缺陷。

采用傳統的葡萄轉基因技術培育抗病毒葡萄的缺點：(1)必需利用完整基因翻譯策略，轉基因產品無法排除安全隱患；(2)轉化植株的抗病毒反應多數表現為延遲發病，屬于耐病性；(3)如果外源基因片段過大，容易出現目的基因僅部分導入或導入基因僅能部分表達的現象；(4)轉化植株高抗病性的獲得往往需要多拷貝。

目前，雖然通過胚挽救的方法可以培育無核葡萄新品種，但由于多數無核葡萄屬于歐亞種，普遍存在抗病性差的缺點，而靠胚挽救這一單一的生物技術手段技術獲得的無核葡萄后代往往比它們的親本更不抗病，更容易受到各種病毒的威脅。

發明內容