[發明專利]一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法

在審

• 申請號: 201510377125.0
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN104988179A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 田莉莉;牛良
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、通過無核葡萄品種間雜交和胚挽救獲得帶無核基因的葡萄合子胚；

步驟2、通過合子胚誘導發生葡萄體細胞胚；

步驟3、構建RNAi抗病毒植物表達載體并轉入根癌農桿菌；

步驟4、農桿菌轉化合子胚來源的體細胞胚獲得再生植株。

2.根據權利要求1所述的獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，其特征在于，所述步驟1中通過無核葡萄品種間雜交和胚挽救獲得帶無核基因的葡萄合子胚具體為：

步驟1.1、開花前3天對母本品種進行人工去雄，去雄后的花序立即用清水噴洗干凈并套袋、掛牌標記；

步驟1.2、去雄后第2-3天用毛筆蘸取父本花粉散落在母本柱頭上進行人工授粉；

步驟1.3、授粉后6周田間采集幼果，自來水沖洗10min；在超凈工作臺上用70％的酒精浸泡1分鐘后，再用0.1％的HgCl₂浸泡消毒8分鐘，無菌水漂洗4次；

步驟1.4、消毒后的果粒置于滅過菌的培養皿中，無菌條件下取出胚珠，接種在合子胚發育培養基上進行胚珠內胚培養，合子胚發育培養基為固液雙相的TL培養基；

步驟1.5、胚珠在合子胚發育培養基上培養6周后，無菌條件下取出發育的幼胚，接種在固體的胚性愈傷組織誘導培養基上；即獲得帶無核基因的葡萄合子胚。

3.根據權利要求2所述的獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，其特征在于，所述TL培養基的組分和含量如下：硝酸鈣250.0mg/L，硝酸鉀600.0mg/L，氯化鉀75.0mg/L，硝酸銨300.0mg/L，硫酸鎂1200.0mg/L，磷酸二氫鉀300.0mg/L，硫酸錳3.0mg/L，碘化鉀0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸鋅0.5mg/L，亞硒酸鈉0.25mg/L，氯化鈷0.025mg/L，硫酸銅0.025mg/L，鉬酸鈉0.025mg/L，檸檬酸鐵10.0mg/L，鹽酸硫胺素0.25mg/L，鹽酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸鈣0.25mg/L，煙酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂6000mg/L，其余為蒸餾水，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；步驟1.5中誘導培養基為：胚性愈傷組織誘導培養基的成分為TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L?2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L。

4.根據權利要求2所述的獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，其特征在于，所述步驟2中通過合子胚誘導發生體細胞胚具體為：

步驟2.1、將步驟1獲得的雜交合子胚接種在固體的胚性愈傷組織誘導培養基上；

步驟2.2、合子胚在胚性愈傷組織誘導培養基上培養4周后，將獲得的黃色、顆粒狀、發育緊實的胚性愈傷組織接種在固體的體細胞胚分化培養基上；

步驟2.3、胚性愈傷組織在體細胞胚分化培養基上培養4周后，即可誘導獲得大量的體細胞胚，此時多數體細胞胚發育時期處在子葉型期。

5.根據權利要求4所述的獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，其特征在于，所述步驟2.1中胚性愈傷組織誘導培養基的成分為TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L?2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L；所述步驟2.3中體細胞胚分化培養基的成分為TL+0.5mg/L?6-BA+2.0mg/L?NAA，其中，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L。