[發明專利]一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201510373995.0
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN104975011A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 黃艷艷;許傳田;吳家強;楊少華;黃慶華;張琳;朱曼玲;高丹丹
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 朱彩霞

技術領域

本發明涉及獸醫生物技術領域的檢測方法，特別涉及檢測雞體抗病毒蛋白的熒光定量PCR試劑盒及其應用。

背景技術

當受到病毒感染時，病原相關的分子模式(pathogen-associated?molecular?pattern,PAMP)被雞體細胞的模式識別受體(pattern-recognition?receptor，PRR)所識別。PRR激活相應配體，啟動雞體固有免疫通路的信號傳導，誘導產生干擾素(Interferon,IFN)和促炎性細胞因子(pro-inflammatory?cytokines)。干擾素進而刺激干擾素誘導基因(IFN-stimulated?genes,ISGs)的表達，產生多種抗病毒蛋白，發揮抗感染的效應。

ISG表達的蛋白中，有3種蛋白在多種病毒感染中發揮著重要的拮抗作用，分別介紹如下。

(1)IFIT

ISGs可以表達一類三角形四鈦重復段蛋白(IFN-induced?protein?with?tetratricopeptide?repeats,IFIT)家族,也稱為ISG56家族。該家族有IFIT1、IFIT2、IFIT3和IFIT54個成員，成簇定位在同一染色體上。各成員均有2個外顯子和1個內含子。在干擾素或病毒等的刺激下，IFIT基因高效表達，產生的蛋白可作用于病毒的復制以及I型干擾素的反饋調節，在雞體抗病毒感染中發揮著重要的作用。

(2)PKR

PKR的全稱為雙鏈RNA(dsRNA)激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Double-Stranded?RNA?dependent?protein?kinase)。PKR在雞體正常生理狀態下表達量少。在受到IFN或病毒復制中產生的dsRNA的刺激時，PKR被激活而發生自體磷酸化，抑制病毒相關基因的翻譯和轉錄。

(3)OASL

OASL，即寡腺苷酸合成酶基因家族樣蛋白(2’,5’-oligoadenylate?synthetase-like?protein)。在IFN或病毒dsRNA的刺激作用下，OASL被激活，進而降解細胞和病毒的RNA，抑制病毒相關蛋白分子的合成，從而發揮其抗病毒感染的作用。因OASL主要在細胞漿中發揮作用，因此其在具有胞漿復制特性的病毒的感染中發揮重要作用。

檢測病毒感染或疫苗免疫雞體抗病毒物質的表達水平，對于深入了解病毒的致病機制，研究開發雞用新型疫苗、免疫增強劑以及抗病毒藥物，均具有非常重要的意義。熒光定量PCR方法具有敏感、快速、實時和所需檢測樣品少等優點。如果能夠開發出商品化的熒光定量PCR系列試劑盒，用于雞體抗病毒效應分子的標準化檢測,將為相關的科學研究和臨床應用帶來極大的便利。

目前尚無商品化的檢測雞體抗病毒蛋白IFIT5，PKR或OASL的試劑盒。熒光定量PCR檢測這些蛋白的技術，僅被部分研究型實驗室所掌握。而且各實驗室所采用的引物、反應體系及循環參數各不相同，導致了實驗結果間的不可比性。

發明內容

本發明旨在提供一種檢測雞體抗病毒蛋白IFIT5，PKR和OASL基因轉錄水平的SYBR?Green?I熒光定量PCR試劑盒及其應用。本發明提供的檢測方法靈敏度高、特異性強、線性濃度范圍廣、重復性好、操作簡便及省時，可用于多種樣品類型中雞IFIT5，PKR和OASL的絕對或相對定量檢測。

為了實現該目的，本發明設計和篩選了三對特異性引物，從新城疫病毒感染的雞胚尿囊液中分別擴增出雞IFIT5，PKR和OASL基因片段。然后，分別制備了這三個基因的質粒標準品，用于熒光定量PCR反應條件的優選和標準曲線的建立。通過實際樣品的檢測應用評估，表明發明所提供的試劑盒可以用作雞正常生理狀態、疫苗免疫以及病毒感染狀態下，多種樣品類型中雞IFIT5，PKR和OASL基因的絕對或相對定量檢測。

本發明具體的技術方案如下。

1.提供了檢測雞IFIT5，PKR和OASL基因的熒光定量PCR特異性引物。本發明使用Primer?Premier?5.0設計特異性PCR引物，經過多對引物的篩選、得到擴增效率和特異性好的一對特異性引物。其核苷酸序列分別為：

引物對一：

IFIT5?Chicken-U：5'-ATGCCGGCTATGCAATAGC-3'；

IFIT5?Chicken-L：5'-CTTGCATTGAAACTTCA-3'

預計擴增片段大小為151bp。

引物對二：