[發(fā)明專利]一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510373995.0
• 申請(qǐng)日: 2015-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN104975011A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃艷艷;許傳田;吳家強(qiáng);楊少華;黃慶華;張琳;朱曼玲;高丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 朱彩霞

1.一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒，其特征在于，包括三對(duì)特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列分別為：

引物對(duì)一：

IFIT5Chicken-U：5'-ATGCCGGCTATGCAATAGC-3'；

IFIT5Chicken-L：5'-CTTGCATTGAAACTTCA-3'

引物對(duì)二：

PKR?Chicken-U：5'-TCACAGATTATAGGTGT-3'；

PKR?Chicken-L：5'-GTTACTCTTTGGTTATAT-3'

引物對(duì)三：

OASL?Chicken-U：5'-ATCATCGAGAGGCGGCTC-3'；

OASL?Chicken-L：5'-TCCGCGCTACAAGGACAGC-3'。

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒，其特征在于，還包括雞IFIT5，PKR和OASL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測雞體抗病毒蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平試劑中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在檢測雞IFIT5，PKR和OASL水平的絕對(duì)定量或相對(duì)定量中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1或2所述試劑盒檢測雞IFIT5，PKR和OASL的熒光定量PCR方法，包括以下步驟，

a.待檢樣品cDNA的制備：

首先提取待檢樣品的RNA，然后使用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備樣品的cDNA；

b.配制PCR反應(yīng)體系：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體系均為20μl，包括：2×熒光定量PCR預(yù)混液10μl,10μM上游引物1μl,10μM下游引物1μl,熒光定量PCR緩沖液2μl,DNA模板2μl和ddH₂O?4μl；

c.設(shè)定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?/p>

95℃預(yù)變性2.5分鐘；95℃7秒，55℃10秒，72℃15秒擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測熒光；熔解曲線分析為95℃15秒，60℃50秒，95℃continuous；最后37℃30秒結(jié)束；

d.結(jié)果分析：

調(diào)整熒光定量PCR的擴(kuò)增基線和閾值設(shè)定，以閾值線不低于正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)；在陽性對(duì)照為有效擴(kuò)增，無模板對(duì)無擴(kuò)增的前提下，讀取待測樣品的Ct值，進(jìn)行結(jié)果判定：Ct值大于40的樣本為陰性結(jié)果；Ct值小于或等于40的樣本為陽性結(jié)果。