[發明專利]重組單鏈負義植物病毒侵染性克隆構建方法及質粒和病毒

有效

• 申請號: 201510371359.4
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN105039388B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 李正和;王強;馬曉楠;錢莎莎;孫凱;周雪平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;C12N7/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發明公開了一種重組單鏈負義植物病毒侵染性克隆構建方法及質粒和病毒。在植物細胞中導入質粒載體的混合物，包括（i）一種轉錄載體，所述轉錄載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子中含有編碼單鏈負義植物病毒反基因組的多核苷酸序列，（ii）至少一種表達載體，包括編碼所述單鏈負義植物病毒衣殼包裝、轉錄和復制所必需的反式作用蛋白，和（iii）可以抑制植物體內基因沉默的沉默抑制子蛋白的多核苷酸序列的一種或多種分離的核酸分子。質粒載體組合物導入植物細胞后可以大量產生重組植物負鏈RNA病毒；侵染性克隆能高效侵染至少一種以上的植物，無需昂貴的儀器、操作簡單、重復性好；利用侵染性克隆可有效用于植物負鏈RNA病毒的反向遺傳學研究。

技術領域

本發明涉及一種重組單鏈負義植物病毒侵染性克隆構建方法及質粒和病毒。

背景技術

病毒反向遺傳學（reverse genetics）技術是20世紀末發展起來的一門研究病毒基因組結構與功能的新興學科，其核心技術是病毒侵染性克隆構建（在動物病毒領域稱為感染性克隆，或病毒拯救技術）。利用侵染性克隆技術可在體外對病毒基因組進行各種修飾和改造，通過分析重組病毒的表型和特性變化研究病毒基因組的結構、明確其基因及產物的功能、理解病毒與宿主的相互作用以及改造和利用病毒載體（外源蛋白表達載體、基因沉默載體和動物病毒疫苗載體等），該技術是現代病毒學研究領域的最基本、最重要的技術手段。在RNA病毒中，由于RNA病毒的基因組RNA本身不能被直接操縱，cDNA克隆技術則提供了一種變通的方法，使RNA病毒的遺傳信息通過cDNA克隆轉變成可以操縱的DNA分子。

正鏈RNA病毒基因組具有信使RNA（mRNA）活性，其基因組RNA一旦導入敏感細胞后可直接作為翻譯模版，合成病毒編碼的復制酶等蛋白，起始病毒的侵染過程。負鏈RNA 病毒無論是其基因組（gRNA），或與之互補的反基因組RNA（agRNA），均不能直接充當mRNA進行病毒蛋白的翻譯，因而單獨導入細胞后不具有侵染活性。此類病毒的最小侵染單元是基因組RNA和核心蛋白（通常包括核衣殼蛋白、RNA 聚合酶及其輔助蛋白）所組成的核糖核蛋白復合物（ribonucleoprotein core complex, RNP）(Conzelmann等，Curr Top MicrobiolImmunol, 2004, 283:1-41)。因此，負鏈RNA病毒侵染性克隆構建需要在寄主細胞內同時表達病毒全部核心蛋白組份及全長基因組RNA。其次，導入細胞的RNA轉錄本兩端需忠實于病毒原始序列時才具有侵染活性（Walpita等，FEMS Microbiol Lett, 2005, 244:9-18；Neumann等，Curr Top Microbiol Immunol, 2004, 283:43-60）。再次，負鏈病毒的gRNA為負鏈，而表達核心蛋白的mRNA為正鏈，當在細胞內同時表達時可形成雙鏈RNA結構，從而干擾這些RNA的模版活性，并引發RNA沉默現象（Roberts等，Virology, 1998, 247:1-6）。最后，負鏈RNA病毒基因組較大（不分段病毒基因組 12 kb以上），或者數目較多（水稻草矮病毒為6條基因組），遺傳操作困難，體內工作效率低。